【正文】 ? DEAESephadexA 50精制透明質(zhì)酸酶 。 ? 對(duì)于一個(gè)特定凝膠柱 ， 待測定物質(zhì)的洗脫體積與分子量的關(guān)系符合公式 ? Ve=KlogM+C 174 分子量的測定 ? （ 1）求解法 :（兩個(gè)已知分子量的蛋白質(zhì)過柱） ? Vel=C－ KlogM1 ? Ve2=C－ KlogM2 ? （ 2）標(biāo)準(zhǔn)曲線法 :（先以 3個(gè)以上已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白過柱 ） : ? 標(biāo)準(zhǔn)曲線法準(zhǔn)確性較高 175 Ve與分子量的關(guān)系 圖 一些球蛋白分子量與 Ve的關(guān)系 柱： 40 ；洗脫液； （含 ） 1．大豆胰蛋白酶抑劑； 2．細(xì)胞色素 C二聚體； 3．胰凝乳蛋白酶原； 4．卵清蛋白； 5．血清白蛋白； 6．血清白蛋白二聚體； 7． γ球蛋白； 8．甲狀腺球蛋白； 9．蔗糖； 10．胰高血糖素； 11．細(xì)胞色素 C5611； 12．細(xì)胞色素 C5611； 13．核糖核酸酶； 14． α乳清蛋白； 15．肌紅蛋白 176 三、凝膠層析在生化制藥中的應(yīng)用 ? （ 一 ） 去熱原 ? 吸附的專一性不強(qiáng) 。 169 ? 分離能力： ? 填料顆粒的 孔徑 大小 ? 孔徑分布 ? 溶質(zhì) 分子量分布 . ? 柱效： ? 溶質(zhì)分子的擴(kuò)散 ? 填料的粒度和分布 ? 填料顆粒的幾何形狀 ? 柱子的尺寸 ? 流速 170 第五節(jié) 凝膠層析的應(yīng)用 一、脫鹽和濃縮 二、分子量測定 三、分離純化 171 一、脫鹽和濃縮 ? 脫鹽 用的凝膠多為 大粒度 的 ， 高交聯(lián)度 的凝膠 。 ? 拐點(diǎn)之間的距離等于 2δ， δ稱為峰的標(biāo)準(zhǔn)偏差 。 ? 結(jié)果： ? （ 1） 溶質(zhì)層變寬 ； ? （ 2） 溶質(zhì)層作為一個(gè)整體以 FV的速度運(yùn)動(dòng) 。 ? （ HETP） m=ωd2pV/Dm ? (1)填料裝得規(guī)整 、 緊密 。 ? (1)小而均勻的填料 ? (2)適當(dāng)?shù)娜軇? ? (3) 提高流速 162 （二）渦流擴(kuò)散 ? 與填料顆粒的形狀 ， 尤其是顆粒尺寸有關(guān) 。 160 一、溶液通過 色譜柱 造成的峰加寬 ? Giddings提出的無規(guī)則行走模型 。 158 （三）薄層凝膠層析 ? 用交聯(lián)葡聚糖作為薄層層析的支撐載體，稱“ 薄層凝膠層析 ” 。 ? 減少 （ WA+WB） 的方法是 適當(dāng)濃縮樣品 、 選用小粒度凝膠 、 流速適當(dāng)減慢 等 。 154 （二）分配系數(shù)測定 ? 分配系數(shù) ? 當(dāng)測得某物質(zhì)的 Ve及 Vt ， 內(nèi)水體積 Vi及外水體積 V0時(shí) ， 算出 Kd及 Kav的值 。d2h Vi=g ? 分部收集器 。 樣品粘度對(duì)洗脫曲線的影響 柱：交聯(lián)葡聚糖 G25， 4 85cm； 流速 180ml/h； 樣品： %血紅蛋白 +%氯化鈉； （ 1）相對(duì)粘度為 ； （ 2）相對(duì)粘度為 ； （ 3）相對(duì)粘度為 149 方法 ? （ 1）直接將樣品加到層析床表面。 ? 檢查物質(zhì)為 藍(lán)色葡聚糖 。 143 凝膠柱床大小與所需凝膠量的關(guān)系 144 （二）凝膠柱的裝填 ? 常用的 支持物 有棉花 、 玻璃纖維 、 玻璃珠 、 垂熔玻璃等 。 142 二、凝膠層析柱的設(shè)計(jì)和制備 ? （ 一 ） 層析柱的選擇 ? 層析柱長度與直徑的比值稱作 “ 柱比 ” 。 ? 粗粒凝膠柱流速高 ， 洗脫峰平坦 ， 分辨率低 ，用于粗制分離 ， 脫鹽 。 ? （ 2）不使分子量分布在凝膠分離范圍的一側(cè)。 ? (2).將分子量相差不大的大分子物質(zhì)加以分離 ， 如分離血清球蛋白與白蛋白 ， 這叫做分級(jí)分離 。 ? Styragel商品 , 分離范圍為 1 600～ 40 000 000。 131 五、多孔玻璃微球 (Bioglas) ? 特點(diǎn)： 化學(xué)穩(wěn)定性高 、 強(qiáng)度大 。 128 Sepharose CL的性質(zhì) 129 （三）超膠（ Utrogel ACA） ? 所謂超膠是 瓊脂糖與聚丙烯酰胺 的混合凝膠 。 125 瓊脂糖凝膠分離范圍 瓊脂糖凝膠有 3個(gè)規(guī)格： Sepharose2B、 4B、 6B分別表示瓊脂糖濃度為 2%， 4%， 6%。 ? 瓊脂糖凝膠的化學(xué)穩(wěn)定性較差 。 ? 如 BioGel P100。 119 Supperdex系凝膠 120 Sephacryl系凝膠 121 三、聚丙烯酰胺凝膠 ? 商品名為 生物凝膠 P（ BioGel P） 。 ? （ 二 ） 交聯(lián)葡聚糖離子交換劑 （ Sephadex –ionexchanger） ? 將活性交換基團(tuán)連接于葡聚糖凝膠上制成的各種交換劑。 ? 濕法：加入一定量的防腐劑置于冰箱中作短期保存 （ 6個(gè)月以內(nèi) ） 。 ? 穩(wěn)定性 。 109 第二節(jié) 凝膠的結(jié)構(gòu)和性質(zhì) ? 一、 葡聚糖凝膠 (Sephadex) ? 二、修飾葡聚糖凝膠 (Modified Sephadex) ? 三、 聚丙烯酰胺凝膠 （ BioGel P） ? 四、 瓊脂糖類凝膠 （ Sepharose ） ? 五、多孔玻璃微球 (Bioglas) ? 六、疏水性凝膠 （ hydrophobic gels） 110 一、葡聚糖凝膠 (Sephadex) ? 商品名為 Sephadex G類 . ? 交聯(lián)葡聚糖的基本骨架是葡聚糖。 ? （ 2） 分離效果較好 ， 重復(fù)性高 。 流徑體積 Ve是全部外水體積加上內(nèi)水體積的一部分 ， 即Ve=V0+KdVi 106 分配系數(shù) Kd ? 排阻系數(shù)： ? ? 當(dāng) Kd=1時(shí) ， 洗脫體積 Ve=V0+Vi， 為全滲入 。 ? 最后流出物質(zhì) C， 它 分子量最小 ， 其分子可以 自由進(jìn)出凝膠顆粒 ， “ 全滲入 ” 。 104 分離過程 ? 三種不同分子量物質(zhì)的混合樣品用某種規(guī)格的凝膠柱進(jìn)行分離。 ? Ve=V0+Vi Kd ? flash 101 （一）平衡排除理論 ? 當(dāng)溶質(zhì)層流過一個(gè)填料顆料這段距離時(shí) ， 溶質(zhì)分子已多次進(jìn)出于填料的孔 ，達(dá)到平衡 。 ? 是將樣品混合物通過一定孔徑的凝膠固定相 ，由于各組分 流經(jīng)體積 的差異 ， 使 不同分子量的組分得以分離的層析方法 。 ? 無機(jī)鹽會(huì)使吸附量增大 ? 溶液的 pH 89 解吸 ? 常用低級(jí)醇、酮或其水溶液解吸 . ? 解吸溶劑能使大孔網(wǎng)狀聚合物吸附劑 溶脹 。 ? 一般 極性吸附劑 適宜于從非極性溶劑 (有機(jī)溶劑 )中 吸附極性物質(zhì) 。 適合 弱電解質(zhì)及非離子型化合物 分離。 ? 次序：水、乙醇、甲醇、乙酸乙酯、 丙酮、氯仿。 能吸附非極性化合物和極性化合物 78 CoQ10制備 ? 79 洗脫劑的選擇 ? 極性溶質(zhì)：極性大的溶劑洗脫能力大； ? 非極性溶質(zhì)：極性小的溶劑洗脫能力大。yH2O Na2Al2O4=2Na++Al2O42 ?? ??? 2 N aZM2MZNa2270 ? 71 三、磷酸鈣凝膠 磷酸鈣 磷酸氫鈣 羥基磷灰石 主要是其中的鈣與蛋白質(zhì)的負(fù)電基團(tuán)結(jié)合 72 胰島素純化 73 四、白陶土 (Kaolin ) 可作為 助濾劑 與去 除熱原的吸附劑 74 五、氫氧化鋁凝膠 將氨水或堿液加入鋁鹽形成的 無定形凝膠 ； 吸附能力和陳化程度有關(guān)。 63 （三）環(huán)境的影響 溶劑：單溶劑易吸附，混合溶劑易解吸 pH值： PI 溫度 鹽的濃度：可能阻止、可能促進(jìn) 64 （四）吸附物濃度和吸附劑用量 對(duì)蛋白質(zhì)或酶進(jìn)行分離時(shí) 要求 濃度1%以下 。 缺點(diǎn)： (1) 選擇性差，收率不高。 52 紅霉素重結(jié)晶 53 用于生物物質(zhì)重結(jié)晶的溶劑一般有 蒸餾水 、 丙酮、石油醚、乙酸乙酯、低級(jí)醇 等。 （三）、晶體純度 晶體