【正文】 試分別繪出采用洗脫展開法、前沿分析法和置換展開法操作時(shí)的流出曲線圖。 高效液相色譜儀 Fermentation Culture supernatant Centrifugation to remove cells Liquid preparation to animal feed market Fermentation Culture supernatant Fermentation Cell pellet Intracellular fraction Animal feed enzyme Analytical enzyme Therapeutic protein Centrifugation to remove cells Centrifugation to remove medium Protein precipitation Cell lysis amp。 ②溶劑系統(tǒng)采用高壓，因此洗脫速度增大。 用免疫親和色譜柱純化干擾素，產(chǎn)品純度比原用方法提高近 10倍。 應(yīng)用親和色譜分離技術(shù)分析血液中纖維蛋白溶酶和纖維蛋白溶酶原的含量 ， 所用的載體基質(zhì)為 Toyopearl HW65(粒徑20～ 40μm， 排除相對分子質(zhì)量 5 106Da)， 使用甘氨酰酞替甘氨酸作隔離體 ， 而固定化配位體為 p氨基苯酰脒 。 與其他色譜分離一樣，可通過改變?nèi)軇┗蚓彌_液的類型，改變緩沖液的 pH和離子強(qiáng)度，改變洗脫溫度，以及添加促溶劑等措施進(jìn)行洗脫。 親和色譜中引入 “ 手臂 ” 原理 親和色譜一般采用柱色譜法。解決的辦法是在載體和配基之間引入適當(dāng)長度的“手臂” (間隔基 )，以減少載體的空間位阻，增加配基的活動(dòng)度。這些載體材料雖然機(jī)械強(qiáng)度較差，傳質(zhì)速率低，但在生物技術(shù)領(lǐng)域中仍被廣泛采用。 親和色譜載體 國際知名牌號(hào)的親和色譜載體基質(zhì)： 美國 Amicon公司的 Matrex CellufineTM(交聯(lián)纖維系 ) 法國 IBF公司的 UltrogelR(聚丙烯酰胺／瓊脂糖 ) 英國 Shandon公司的 Hyperil WP300TM(硅 ) 日本東洋曹達(dá)公司的 Toyopearl， 等等 載體基質(zhì)的特性對分離純化效果至關(guān)重要。 親和色譜所用固定相載體是由對生化物質(zhì)有特異親和力的配位體偶聯(lián)在惰性載體上構(gòu)成。針對某一生物大分子的分離，需要制備專一的配基，并選擇特定的色譜條件。后者則指固定相配基對一類基團(tuán)有極強(qiáng)的親和關(guān)系，如一些輔酶 (NAD+， NADP+， ATP等 )能與許多需要這些輔酶才起催化作用的酶發(fā)生親和結(jié)合。 親和色譜操作示意圖 (● 目標(biāo)產(chǎn)物， ?雜蛋白 ) 根據(jù)選擇性的高低，可將親和色譜分為 專一性 和 基團(tuán)性 兩類。 其顯著特點(diǎn)是 高選擇性 ，且色譜過程操作條件溫和，能有效地保持生物大分子高級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，活性樣品的回收率也比較高。 IEC柱： 75 ， TSK ge1 SP—5PW； A液： ／ L磷酸鹽／乙腈 (70／ 30)， ； B液： ／ L磷酸鹽／乙腈 (70／ 30)， ； 梯度：線性 A→ B(30min)；流量＝ ／ min； 圖中： 1–催產(chǎn)肽； 2–腦啡肽； 3–TRH； 4 –α–內(nèi)啡肽； 5 – LHRH ； 6–神經(jīng)降壓素； 7–αMSH； 8 –血管緊張肽 II； 9–P物質(zhì)； 10–β內(nèi)啡肽 IEC分離激素多肽 親和色譜 (Affinity Chromatoraphy， AFC) 親和色譜 是專門用于純化生物大分子的色譜技術(shù)。 IEC的應(yīng)用及特點(diǎn) IEC是蛋白質(zhì)、肽和核酸等生物產(chǎn)物的主要純化手段。 線性梯度洗脫過程中，流動(dòng)相的離子強(qiáng)度線性增大，因此溶質(zhì)分配系數(shù)連續(xù)降低，移動(dòng)速度逐漸增大，使恒定洗脫條件下難于洗脫的溶質(zhì) B在較小的流動(dòng)相體積下洗脫。 如果采用離子強(qiáng)度不變的流動(dòng)相進(jìn)行恒定洗脫，兩種蛋白質(zhì)的洗脫體積相差很大，甚至分配系數(shù)大的蛋白質(zhì)很難洗脫，造成洗脫劑的大量消耗和洗脫時(shí)間的大幅度增加。 名 稱 基 質(zhì) 制造商 名 稱 基 質(zhì) 制造商 S e pha de x G( 10 200) 交聯(lián)葡聚糖 P ha rma c ia B io B e a ds S X 系列 苯乙烯 二乙烯苯 B ioR a d S e pha rose 2 B ,4B ,6 B 瓊脂糖 P ha rma c ia B io Ge l P 系列 聚丙烯酰胺 B ioR a d S e pha rose CL 4 B , 6B 交聯(lián)瓊脂糖 P ha rma c ia B io Ge l A 系列 瓊脂糖 B ioR a d Se pha c r y l S 系列 聚丙烯酰胺 葡聚糖 P ha rma c ia TSKg e l S W 系列 硅膠 T o y o S oda S upe rde x 系列 高交聯(lián)瓊脂糖 P ha rma c ia TSKg e l T o y ope a r l H W系列 親水性聚乙烯醇 T o y o S oda 葡聚糖 TSKg e l P W 系列 親水性聚乙烯 T o y o S oda S upe rose 系列 高交聯(lián)瓊脂糖 P ha rma c ia TSKg e l C W 35 纖維素 T o y o S oda ( 二次交聯(lián) ) C e ll ulofine 纖維素 C hiss o 蛋白質(zhì)等生物大分子為多價(jià)電解質(zhì)， pH偏離等電點(diǎn)的溶液中凈電荷數(shù)常為兩位數(shù)以上，故 B值比較大。用于離子交換色譜分離的凝膠基質(zhì)如下表。 (7–68) 離子交換色譜 常用于蛋白質(zhì)等生物分子離子交換的陰離子交換基有： DEAE(二乙胺乙基，適用范圍 pH＜ ； QAE(季銨乙基 )。 荷電溶質(zhì)在離子交換劑上的分配系數(shù)可用下式表示： ??? ，dBd KIAIK )(其中， I為流動(dòng)相的離子強(qiáng)度， A和 B為常數(shù)， Kd,∞ 為離子強(qiáng)度無限大時(shí)溶質(zhì)的分配系數(shù)，是靜電相互作用以外的非特異性吸附引起的溶質(zhì)在離子交換劑上的分配。 作為脫鹽手段， GFC比透析法速度快，精度高；與超濾法相比，剪切應(yīng)力小，蛋白質(zhì)活性收率高。 rd MbaK l o g??(7–67) 4． GFC的特點(diǎn) GFC最大特點(diǎn)是操作簡便，凝膠過濾介質(zhì)價(jià)廉易得，適合于大規(guī)模分離純化過程。經(jīng)過鹽析沉淀獲得的蛋白質(zhì)溶液中鹽濃度很高，一般不能直接進(jìn)行離子交換色譜分離，可首先用GFC脫鹽。 1．分離純化 GFC用于相對分子質(zhì)量從幾百到 106數(shù)量級(jí)的物質(zhì)的分離純化，在蛋由質(zhì)、肽、脂質(zhì)、抗生素、糖類、核酸以及病毒 (50400nm)的分離與分析中頻繁使用。 dp＝ 44μ m； BSA—牛血清白蛋白； OA—蛋清白蛋白； Mb——肌紅蛋白； B12—維生素 12 中壓 GFC的 HETP與線速度的關(guān)系 (759) CuBuAH E T P ???正常操作下，HETP為凝膠粒徑的 2－ 3倍 影響分離特性的因素 2. 料液體積 為得到較高的分離度，料液體積需根據(jù)溶質(zhì)之間分配系數(shù)的差別控制在適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)，在不影陶分離度的前提下取最大值。利用環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)制備的Sepharo