【正文】 30天的未成熟種子放入研缽中，加入液氮，迅速將花生豆研磨成粉末狀，轉(zhuǎn)移至提取液中，混勻，冰浴 30min。 3) 4℃ ， 8000rpm,離心 13min。 4) 取上清，加入等體積的苯酚 :氯仿 :異戊醇（ 25:24:1）， 4℃ ， 12022rpm,離心 5min. RNA提取的通用方法 5) 取上清，加入 3mol/l KAc(),混勻，冰浴 30min, 4℃ ，13000rpm,離心 15min. 6) 取上清，加入 2倍體積無水乙醇， 20℃ 放置 1h, 4℃ ， 8000rpm,離心13min。 7) 棄上清，在沉淀中加入 1ml 4mol/LLicl,使溶解，移入 中，冰浴 2h, 4℃ ， 13000rpm, 離心 15min. 8) 棄上清，在沉淀中加入 400uldH2O（經(jīng) DEPC處理），再加入 400ul氯仿，混勻， 4℃ ， 13000rpm, 離心 6min. 9) 取上清，加入 3mol/l NaAc(),2倍體積無水乙醇， 20℃ 放置， 30min， 4℃ ， 13000rpm,離心 13min. 10) 棄上清，將沉淀 RNA用 70%乙醇洗滌 2次，室溫下干燥（ 70%乙醇用DEPC處理水配制） 11) 加入 100ul dH2O（經(jīng) DEPC處理）溶解， 20℃ 保存。 RNA提取的通用方法 影響 RNA提取的因素 ? 材料 ： ? 新鮮，切忌使用反復凍融的材料 ? 如若材料來源困難，且實驗需要一定的時間間隔?？梢韵葘⒉牧腺A存在 TRIzol或樣品貯存液中，于－ 70℃ 或－ 20℃ 保存 ? 如要多次提取，請分成多份保存 ? 液氮長期保存，－ 70℃ 短期保存 提取的因素影響 RNA提取的因素 ? 樣品破碎及裂解 ： ? 根據(jù)不同材料選擇不同的處理方法： ? 培養(yǎng)細胞： 通?？芍苯蛹恿呀庖毫呀? ? 酵母和細菌： 一般 TRIzol可直接裂解，對于一些特殊的材料可先用酶或者機械方法破壁 ? 動植物組織： 先液氮研磨和勻漿，后加裂解液裂解。期間動作快速，樣品保持冷凍 ? 樣品量適當，保證充分裂解 ? 為減少 DNA污染，可適當加大裂解液的用量 提取的因素? 純化： ? 在使用氯仿抽提純化時，一定要充分混勻，且動作快速； ? 經(jīng)典的純化方法，如 LiCl 沉淀等，雖然經(jīng)濟，但操作時間長，易造成 RNA 降解； ? 柱離心式純化方法：抽提速度快，能有效去除影響 RNA 后續(xù)酶反應的雜質(zhì)，是目前較為理想的選擇。 影響 RNA提取的因素 第一部分： DNA提取方法簡介 第二部分： DNA提取常見問題、 原因分析及其對策 內(nèi)容 第三部分： RNA提取方法簡介 第四部分： RNA提取及其 RTPCR常見 問題、原因分析及其對策 RNA提取常見問題 ? RNA 的降解 ? OD260 /OD280 比值偏低 ? 電泳帶型異常 ? 下游實驗效果不佳 RNA降解 ? 新鮮細胞或組織： ? 裂解液的質(zhì)量 ? 外源 RNase的污染 ? 裂解液的用量不足 ? 組織裂解不充分 ? 另外某些富含內(nèi)源酶的樣品 (如脾臟 ， 胸腺等 )， 很難避免 RNA 的降解 。 建議在液氮條件下將組織碾碎 ， 并且勻漿時使用更多裂解液 。 RNA降解 ? 冷凍樣品： ? 樣品取材后應立即置于液氮中速凍 ， 然后可以移至70℃ 冰箱保存 。 樣品要相對小一點； ? 先用液氮研磨 ， 再加裂解液勻漿； ? 樣品與裂解液充分接觸前避免融化 ， 研磨用具必須預冷 ， 碾磨過程中及時補充液氮 。 OD260 /OD280 比值偏低 ? 蛋白質(zhì)污染： ? 不要吸入中間層及有機相 ， 加入氯仿后首先混勻 ， 并且離心分層的離心力和時間要足夠 。 ? 減少起始樣品量 ， 確保裂解完全 、 徹底 ? 解決辦法 :重新抽提一次 ， 再沉淀 ， 溶解 。 ? 苯酚殘留： ? 不要吸入中間層及有機相 ， 加入氯仿后首先混勻 ， 并且離心分層的離心力和時間要足夠 。 ? 解決辦法 :重新抽提一次 ， 再沉淀 ， 溶解 。 OD260 /OD280 比值偏低 ? 抽提試劑殘留： ? 確保洗滌時要徹底懸浮 RNA， 并且徹底去掉 75% 乙醇 。 ? 解決辦法 :再沉淀一次后 ， 溶解 。 ? 設備限制： ? 測定 OD260 及 OD280 數(shù)值時 ， 要使 OD260 讀數(shù)在 之間 。 此范圍線性最好 。 ? 用水稀釋樣品： ? 測 OD 時 ， 對照及樣品稀釋液請使用 10 mM Tris， pH 。 用水作為稀釋液將導致比值的降低 。 電泳帶型異常 ? 非變性電泳： ? 上樣量超過 3ug，電壓超過 6V/cm，電泳緩沖液陳舊，均可能導致 28S 和 18S 條帶分不開。 ? 變性電泳條帶變淡： ? EB 與單鏈的結(jié)合能力要差一些，故同樣的上樣量，變性電泳比非變性電泳要淡一些； ? 甲醛的質(zhì)量不高 。 下游實驗效果不佳 ? RNA 降解 ? 抽提試劑的殘留 75% 乙醇洗滌 ? 樣品中雜質(zhì)的殘留 多糖等雜質(zhì)，再次沉淀 ? DNA 污染 使用 RNaseFree 的 DNase I 消化抽提 RNA RT常見問題分析和解決方案 問題一： 少量或沒有 RTPCR產(chǎn)物 RNA降解 分離無污染，高質(zhì)量的 RNA；防止 RNA降解 RNA中含逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑 70％（ v/v）乙醇清洗 RNA沉淀，除去抑制劑 起始 RNA量太低 增加 RNA的量 多糖同 RNA共沉淀 用氯化鋰沉淀 RNA以除去多糖 合成 cDNA第一鏈合成的引物退火失敗 確定退火溫度適合所用的引物 RNA模板存在較多二級結(jié)構(gòu) 將 RNA和引物在不含鹽及緩沖液條件下變性 /退火，提高逆轉(zhuǎn)錄反應溫度 反轉(zhuǎn)錄成功， PCR失敗 PCR步驟中使用超過 1/5的逆轉(zhuǎn)錄反應產(chǎn)物 可能原因 解決方案 RT常見問題分析和解決方案 問題二： 有非特異性帶 ? 引物和模板的非特異性退火 ? 基因特異性引物設計較差 ? RNA中有基因組 DNA的污染 ? 形成引物二聚體 ? 鎂離子濃度太高 提高反應的溫度和特異性 提高引物的特異性 使用擴增級 DNaseⅠ 處理 RNA 設計在 339。端沒有互補序列的引物 優(yōu)化鎂離子濃度 可能原因 解決方案 RT常見問題分析和解決方案 問題三： 產(chǎn)生彌散（ smear）條帶 ? 第一鏈產(chǎn)物的含量過高 ? PCR反應中引物過多 ? 循環(huán)數(shù)過多 ? 退火溫度過低 ? 寡核苷酸片段產(chǎn)生的非特異性擴增 常規(guī) PCR步驟中減少第一鏈產(chǎn)物的量 減少引物的用量 減少 PCR的循環(huán)次數(shù) 提高退火溫度 提取高質(zhì)量 RNA，防止被 DNA污染 可能原因 解決方案 謝謝！