【正文】 第二講 核酸提取技術 Part Two Techniques of Nucleic Acid Isolation 第一部分： DNA提取方法簡介 第二部分： DNA提取常見問題、 原因分析及其對策 內容 第三部分： RNA提取方法簡介 第四部分： RNA提取及其 RTPCR常見 問題、原因分析及其對策 核酸是遺傳信息的載體，是最重要的生物信息分子，是分子生物學研究的主要對象，因此核酸的提取是分子生物學實驗技術中最重要、最基本的操作 。 前言 第一部分： DNA提取方法簡介 第二部分： DNA提取常見問題、 原因分析及其對策 第三部分： RNA提取方法簡介 第四部分： RNA提取及其 RTPCR常見 問題、原因分析及其對策 DNA 提取 的基 本步 驟 DNA提取的幾種方法 ? 基因組 DNA的提取 ? CTAB法 ? SDS法 ? 其它 DNA提取的幾種方法 ? 非基因組 DNA的提取 ? 質粒 DNA的提取 ? 堿裂解法 ? 煮沸法 ? 線粒體、葉綠體 DNA的提取 ? 差速離心結合 SDS裂解法 基因組 DNA－ CTAB法 ? CTAB法原理 （植物 DNA提取經典方法） ? CTAB（ cetyl trimethyl ammonium bromide，十六烷基三甲基溴化銨），是一種陽離子去污劑，可溶解細胞膜，并與核酸形成復合物。 ? 該復合物在高鹽溶液中（ ）是可溶的，通過有機溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。 注： CTAB溶液在低于 15℃ 時會形成沉淀析出，因此在將其加入冰冷的 植物材料之前必須預熱，且離心時溫度不要低于 15℃ 。 ? CTAB提取緩沖液的經典配方 組份 TrisHCl （ ） EDTA （ ） NaCl CTAB β巰基乙醇 終濃度 100 mM 20 mM 2%(W/V) %（ V/V）使用前加入 ? TrisHCl （ ） 提供一個緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞； ? EDTA螯合 Mg2+或 Mn2+離子，抑制 DNase活性； ? NaCl 提供一個高鹽環(huán)境，使 DNA充分溶解，存在于液相中； ? CTAB溶解細胞膜，并結合核酸，使核酸便于分離； ? β巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除 基因組 DNA－ CTAB法 ? CTAB提取緩沖液的改進配方 組份 TrisHCl （ ） EDTA （ ） NaCl CTAB PVP40 β巰基乙醇 終濃度 100 mM 20 mM 3%(W/V) 5%(W/V) 2%（ V/V）使用前加入 ? PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的絡合物，能與多酚形成一種不溶的絡合物質，有效去除多酚，減少 DNA中酚的污染；同時它也能和多糖結合，有效去除多糖。 基因組 DNA－ CTAB法 基因組 DNA－ CTAB法 十六烷基三甲基溴化銨 ? CTAB法流程圖 植物材料 裂解液 上層溶液 液氮研磨 抽提 細胞裂解 干燥溶解 離心洗滌 酒精沉淀 DNA溶液 基因組 DNA－ CTAB法 ? CTAB法實例 65℃ 預熱。 取材料 ，用液氮研磨（加入 ）迅速研磨成粉。 將凍粉迅速轉入提取液中，盡快用移液槍混勻，在溫度 65℃ 水浴 30min，期間輕輕搖動幾次（防止 DNA斷裂）。 取出離心管，冷至室溫，每管加等體積氯仿 /異戊醇（ 24： 1），輕輕混勻，顛倒混勻靜止 10min， 10000rpm離心 10min。 吸取上清夜于另一離心管中，加入 1/10體積的 3%CTAB，混勻；再加入等體積的氯仿 /異戊醇（ 24： 1），輕緩顛倒混勻，室溫放置 15min，然后10000rpm離心 10min去上清。 分別用 70%、 80%酒精洗滌沉淀。在風扇下將沉淀吹干。 基因組 DNA－ CTAB法 ? CTAB法實例 加 30μlTE緩沖液回溶 DNA沉淀（不要反復吸打，用手指輕彈），同時加入終濃度 50μl/mg RNase，置 37℃ 處理 1h。 加入等體積的氯仿 /異戊醇 （ 24： 1）抽提 13次。 吸取上清，加入終濃度為 ， 2倍體積的無水乙醇，放置1h左右， 12022rpm 離心 10min 除去上清夜。 1用 70%乙醇洗滌沉淀 23次，自然干燥后，溶于 30μl去離子水中形成 DNA提取液。 1以 DNA提取液 /去離子水 1/100的比例加入石英杯中在蛋白質核酸分析儀中進行測定。 基因組 DNA－ CTAB法 ? SDS法原理 基因組 DNA－ SDS法 ? SDS是一種陰離子去垢劑 ， 在高溫 （ 55～ 65℃ ） 條件下能裂解細胞 ， 使染色體離析 ， 蛋白變性 ， 釋放出核酸； ? 提高鹽 (KAc或 NH4Ac)濃度并降低溫度 （ 冰浴 ） ， 使蛋白質及多糖雜質沉淀 ， 離心后除去沉淀； ? 上清液中的 DNA用酚 /氯仿抽提 ， 反復抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。 組份 TrisHCl （ ） EDTA （ pH ） NaCl SDS 終濃度 10 mM 20 mM 2% ? SDS法 DNA提取緩沖液 ? SDS法流程圖 （以動物組織為例） 動物組織 細胞裂解 上層溶液 組織勻漿 抽提 干燥溶解 離心洗滌 酒精沉淀 DNA溶液 基因組 DNA－ SDS法 ? SDS法實例 取 ，置液氮中研磨成粉。 將凍粉轉移置 65℃ 預熱的 450μl DNA提取液中，輕輕晃動，使凍粉充分散開。 加入 30μl 10%SDS 充分混勻，置 65℃ 水浴中保溫 1015 min （間隔晃動 23次） 加入 48μl KAC充分混勻，冰浴中放置 30 min 。 4℃ 12022rpm 離心 15 min。 上清轉入另一離心管中，加入等體積氯仿 /異戊醇（ 24： 1），輕扣，倒離心管數次，放置片刻，于 4℃ 8000rpm離心 10min。 按 67重復 12次。 將上清轉移另一離心管，加入 2倍體積冷無水乙醇。輕緩搖勻，置 20℃ 沉淀 。 4℃ 10000rpm離心 10min。 基因組 DNA－ SDS法 倒掉上清，用 70%乙醇洗滌沉淀 23次，吹干后，用 30μl去 TE緩沖液溶解沉淀。 DNA溶液加入 RNase 1μl，于 37℃ 保溫 。 1用等體積的氯仿 /異戊醇（ 24： 1）抽提 13次 1 70%乙醇洗滌沉淀 23次，自然干燥后，溶于 30μl 去離子水形成 DNA提取液。 1以 DNA提取液 /去離子水 1/100的比例加入石英杯中在蛋白質核酸分析儀中進行測定。