dna重組技術(shù)(已修改)
2025-08-16 13:27 本頁面
【正文】 第六章 重組 DNA技術(shù)的操作A DNA的體外重組（切、接）B 用于基因轉(zhuǎn)移的受體菌或細胞C 重組 DNA分子的轉(zhuǎn)化和擴增（轉(zhuǎn)、增） D 轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢）第六章 重組 DNA技術(shù)的操作過程切 接 轉(zhuǎn)增檢一 DNA的體外重組（切與接）第六章 重組 DNA技術(shù)的操作過程同種內(nèi)切酶生產(chǎn)的粘性末端的連接同尾酶生產(chǎn)的粘性末端的連接不同粘性末端的連接粘性末端的更換人工粘性末端的連接重組率n 外源 DNA片段同載體分子連接的方法，即 DNA分子體外重組技術(shù)，主要是依賴于核酸內(nèi)切限制酶和 DNA連接酶的作用。n 一般說來在選擇外源 DNA同載體分子連接反應(yīng)程序時，需要考慮到下列三個因素： (1) 實驗步驟要盡可能地簡單易行， (2) 連接形成的 “ 接點 ” 序列，應(yīng)能被一定的核酸內(nèi)切限制酶重新切割，以便回收插入的外源 DNA片段， (3) 對轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯過程中密碼結(jié)構(gòu)的閱讀不發(fā)生干擾。 F重組率重組率的定義 重組率 = 含有外源 DNA的重組分子數(shù) / 載體分子總數(shù) 在常規(guī)實驗條件下，重組率一般為 25 75% 重組率是衡量連接反應(yīng)效率的重要指標，較高的重組率可以 大大簡化 DNA重組的后續(xù)操作。F重組率提高重組率的方法 提高外源 DNA片段與載體的分子比 ： 5 : 1 10 : 1 載體 DNA分子在連接前先除去磷酸基團： 539。 539。GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI539。GCTTAA pAATTCG539。 p539。 GCTTAA OH 539。 539。 AATTCG539。 HO退火539。 GAATTCCTTAA G 539。G AATTCCTTAAGOHHOOHHO堿性磷酸單酯酶 堿性磷酸單酯酶二 用于基因轉(zhuǎn)移的受體菌或細胞各種基因工程受體的特性實驗室常用的基因工程受體受體細胞應(yīng)具備的條件 一、宿主的選擇n 從安全性考試，應(yīng)具備以下條件： 1. 不適合在人體內(nèi)生存 2. 不適合在非培養(yǎng)條件下生存 3. 在非培養(yǎng)條件下，其 DNA容易解體 4. 它的 DNA不易轉(zhuǎn)移 5. 它的質(zhì)粒只在這一宿主由復制 6. 便于檢測 A 受體細胞應(yīng)具備的條件從遺傳性考慮： recA－， 用于基因擴增或高效表達的受體細胞（ recA） ，或是修飾系統(tǒng)的缺陷。避免對外源 DNA的除解。外切酶和內(nèi)切酶活性缺陷（ recB， recC， hsdR） （ 具有與載體選擇標記互補的表型） 4. 具有較高的轉(zhuǎn)化效率 A 受體細胞應(yīng)具備的條件B 各種基因工程受體的特性大腸桿菌 遺傳背景清楚，載體受體系統(tǒng)完備，生長迅速，培養(yǎng)簡單，重組子穩(wěn)定 適用于外源 DNA的擴增和克隆、原核生物基因的高效表達、基因文庫的構(gòu)建，是 DNA重組實驗和基因工程的主要受體菌 產(chǎn)物結(jié)構(gòu)復雜、種類繁多的內(nèi)毒素B 各種基因工程受體的特性枯草桿菌 遺傳背景清楚，蛋白質(zhì)分泌機制健全 ，生長迅速，培養(yǎng)簡單，不產(chǎn)內(nèi)毒素 適用于原核生物基因的克隆、表達以及重組蛋白多肽的有效分泌 遺傳欠穩(wěn)定，載體受體系統(tǒng)欠完備B 各種基因工程受體的特性鏈霉菌抗生素的主要生產(chǎn)者，分子遺傳相對操作簡便，不產(chǎn)內(nèi)毒素主要用于抗生素生產(chǎn)菌株的改良遺傳不穩(wěn)定，生長相對緩慢B 各種基因工程受體的特性酵母菌 具有真核生物的特征，遺傳背景清楚，生長迅速，培養(yǎng)簡單，外源基因表達系統(tǒng)完善，遺傳穩(wěn)定 適用于外源 DNA的擴增、克隆以及真核生物基因的高效表達、基因文庫的構(gòu)建、真核生物基因表達調(diào)控的研究，是 DNA重組實驗和基因工程重要的真核性受體菌 內(nèi)源性蛋白產(chǎn)物種類繁多且含量高B 各種基因工程受體的特性昆蟲細胞（家蠶） 具有真核生物的特征，外源基因表達量高，繁殖相對較快，培養(yǎng)成本低廉，遺傳穩(wěn)定 適用于真核生物基因的高效表達 DNA重組操作系統(tǒng)欠完善B 各種基因工程受體的特性哺乳動物細胞（中國 倉鼠卵巢細胞 CHO） 與人的親緣關(guān)系近，分子重組表達系統(tǒng)健全，具有合適的糖基化修飾系統(tǒng) 適用于哺乳類動物和人的基因表達調(diào)控研究、基因藥物的生產(chǎn)，是 DNA重組實驗和基因工程的主要哺乳動物受體 細胞培養(yǎng)條件苛刻，生長緩慢 B 各種基因工程受體的特性植物細胞（擬南芥菜、煙葉 ） 農(nóng)作物的經(jīng)濟意義重大，轉(zhuǎn)基因植物細胞易于分化，細胞培養(yǎng)簡單且成本低廉，具有光合作用 適用于高等植物基因表達調(diào)控的研究、基因藥物的生產(chǎn)，農(nóng)作物品質(zhì)的改良 遺傳操作繁瑣 C 實驗室常用的基因工程受體大腸桿菌用于接受質(zhì)粒： C600、 W31 HB10 JM8 JM101（ Aps、 Tc
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