dna重組技術(編輯修改稿)
2025-08-31 13:27 本頁面
【文章內容簡介】 率的影響因素 載體及 DNA重組分子方面： 載體本身的性質 ：不同的載體轉化同一株受體細胞，其轉化率不同 載體的空間構象 ：質粒的超螺旋構象轉化率最高，經酶切連接操作后的載體由于空間構象難以恢復，其轉化率一般要比新制備的超螺旋質粒低兩個數(shù)量級 插入片段的大小 ：對質粒載體而言，插入片段越大，轉化效率越低 B 轉化率轉化率的影響因素 受體細胞方面： 受體細胞必須與載體相匹配，例如： pBR322轉化大腸桿菌 JM83株，轉化率很低；但對大腸桿菌 ED8767株的轉化率則較高 B 轉化率轉化率的影響因素 轉化方法方面： 受體細胞的預處理 ： 影響最大供受體的比例 ：Ca2+誘導轉化 ml 感受態(tài) 細胞 50 ng DNA 轉化方法 ：Ca2+誘導轉化 106 107 / mg DNA 原生質體轉化 109 個 原生質體 50 ng DNA 原生質體轉化 105 106 / mg DNA lDNA轉染 107 108 / mg DNA 電穿孔轉化 106 109 / mg DNA C 轉化細胞的擴增擴增操作 轉化細胞的擴增操作是指轉化完成之后細胞的短時間培養(yǎng)。在實驗時，擴增操作往往與轉化操作偶聯(lián)在一起，如： Ca2+誘導轉化后的 37℃ 培養(yǎng) 一個 小時 原生質體轉化后的再生過程 l噬菌體轉染后的 30℃ 培養(yǎng)等，均屬擴增操作 C 轉化細胞的擴增擴增操作的目的增殖轉化細胞，使得有足夠數(shù)量的轉化細胞用于篩選程序 擴增和表達載體分子上的標記基因，便于篩選 表達外源基因，便于篩選和鑒定 四 轉化子的篩選和鑒定（檢）載體遺傳標記檢測克隆 DNA序列檢測外源基因產物檢測四 轉化子的篩選和鑒定（檢） 由于重組率和轉化率不可能達到理想極限，因此必須借助各種篩選和鑒定方法區(qū)分 轉化子 與非轉化子 、 重組子 與非重組子、 目的重組子 與非目的重組子轉化子 重組子 目的重組子A載體遺傳標記檢測抗藥性篩選法ROPROISal IBamH ITcrPvu IPst IPst IEcoR ICla IHind IIIHind IIBal IApr抗藥性篩選法的基本原理： pBR3224363 bpori抗藥性篩選法可區(qū)分 轉化子 與非轉化子、 重組子 與非重組子將外源 DNA片段插在 EcoRI位點： 非重組子呈 Apr、 Tcr 重組子呈 Apr、 Tcr 將外源 DNA片段插在 BamHI位點： 非重組子呈 Apr、 Tcr 重組子呈 Apr、 Tcs A 載體遺傳標記檢測抗藥性篩選法抗藥性篩選法的基本操作： 先將轉化液涂布含有 Ap的平板再將 Ap平板上的轉化子影印至含有 Ap和 Tc的平板上 在 Ap平板上生長、但在 Ap和 Tc平板上 不長的轉化子即為 ApAp + Tc影印挑選重組子 A載體遺傳標記檢測營養(yǎng)缺陷型篩選法 營養(yǎng)缺陷型篩選法的基本原理： 營養(yǎng)缺陷型篩選法可以區(qū)分 轉化子 與非轉化子，一般不能區(qū)分 重組子 與非重組子。其原理是：載體分子上攜帶某種營養(yǎng)組份的合成基因，而受體細胞本身不能合成這一營養(yǎng)組份，將轉化細胞涂布在不含此營養(yǎng)組份的培養(yǎng)基上，長出的便是轉化子 A載體遺傳標記檢測營養(yǎng)缺陷型篩選法 常見的營養(yǎng)缺陷型篩選標記： 哺乳動物細胞中存在兩條 dTTP的合成途徑： 用于 大腸桿菌 的營養(yǎng)標記基因常選用色氨酸生物合成基因 trp+用于高等 哺乳動物細胞 的營養(yǎng)標記基因常使用胸腺嘧啶核苷激酶 基因 tk， 相應的受體細胞則選擇 tk缺陷型dCDP dTDP dTTPTR dTMP dTDP dTTPAPTKAP 氨基喋呤TK 胸腺嘧啶核苷激酶n 胸腺嘧啶核苷激酶簡稱胸苷激酶（ thymidine Kinase,TK） 在所有真核細胞中都有表達 , 是嘧啶生物合成補救代謝途徑中的一個關鍵酶 , 它可催化胸苷磷酸化轉變成為 dTMP, 繼續(xù)磷酸化生成 dTTP, 參與 DNA的生物合成。含有胸腺嘧啶核苷激酶（ TK） 編碼基因缺陷的受體細胞（ tk ）不能在含有次黃嘌呤 (H)、氨基喋呤 (A)、胸腺嘧啶核苷 (T)的培養(yǎng)基上（ HAT培養(yǎng)基 ）生長，載體上的標記基因 tk能與之遺傳互補 . TK細胞因氨基喋呤抑制了 dTTP的合成而死亡， TK+細胞可存活，以此進行篩選 .A載體遺傳標記檢測顯色篩選法顯色篩選法的基本原理： 顯色篩選法可以區(qū)分 轉化子 與非轉化子，也可區(qū)分 重組子與非重組子。其原理是：載體分子上攜帶某種顯色酶基因，其表達產物能使細胞產生顏色反應，從而易于辨認和挑選，如大腸桿菌質粒 pUC18攜帶的 lacZ’基因（藍色反應）、鏈霉菌質粒pIJ702攜帶的 melC基因（黑色反應）等A載體遺傳標記檢測顯色篩選法顯色篩選法的基本操作： pUC18AprlacZ39。oriAp + Xgal重組子（ Apr + lacZ
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