【正文】 到實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的重組率為 20%，所以實(shí)際投入載體應(yīng)為： / 20% = mg 載體 DNA 載體投入量確定后，外源 DNA的投入量即可按 10∶1的要求算出（ 5 mg），甚至還可以估算需要涂布多少塊平板進(jìn)行篩選 B 轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率的影響因素 載體及 DNA重組分子方面： 載體本身的性質(zhì) ：不同的載體轉(zhuǎn)化同一株受體細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化率不同 載體的空間構(gòu)象 ：質(zhì)粒的超螺旋構(gòu)象轉(zhuǎn)化率最高，經(jīng)酶切連接操作后的載體由于空間構(gòu)象難以恢復(fù)，其轉(zhuǎn)化率一般要比新制備的超螺旋質(zhì)粒低兩個(gè)數(shù)量級 插入片段的大小 ：對質(zhì)粒載體而言，插入片段越大，轉(zhuǎn)化效率越低 B 轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率的影響因素 受體細(xì)胞方面： 受體細(xì)胞必須與載體相匹配，例如： pBR322轉(zhuǎn)化大腸桿菌 JM83株，轉(zhuǎn)化率很低；但對大腸桿菌 ED8767株的轉(zhuǎn)化率則較高 B 轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率的影響因素 轉(zhuǎn)化方法方面： 受體細(xì)胞的預(yù)處理 ： 影響最大供受體的比例 ：Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化 ml 感受態(tài) 細(xì)胞 50 ng DNA 轉(zhuǎn)化方法 ：Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化 106 107 / mg DNA 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化 109 個(gè) 原生質(zhì)體 50 ng DNA 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化 105 106 / mg DNA lDNA轉(zhuǎn)染 107 108 / mg DNA 電穿孔轉(zhuǎn)化 106 109 / mg DNA C 轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增擴(kuò)增操作 轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增操作是指轉(zhuǎn)化完成之后細(xì)胞的短時(shí)間培養(yǎng)。GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI539。 GCTTAA OH 539。含有胸腺嘧啶核苷激酶（ TK） 編碼基因缺陷的受體細(xì)胞（ tk ）不能在含有次黃嘌呤 (H)、氨基喋呤 (A)、胸腺嘧啶核苷 (T)的培養(yǎng)基上（ HAT培養(yǎng)基 ）生長，載體上的標(biāo)記基因 tk能與之遺傳互補(bǔ) . TK細(xì)胞因氨基喋呤抑制了 dTTP的合成而死亡， TK+細(xì)胞可存活，以此進(jìn)行篩選 .A載體遺傳標(biāo)記檢測顯色篩選法顯色篩選法的基本原理： 顯色篩選法可以區(qū)分 轉(zhuǎn)化子 與非轉(zhuǎn)化子，也可區(qū)分 重組子與非重組子。其原理是在體外無細(xì)胞的轉(zhuǎn)譯中利用 cDNA與 mRNA雜交后導(dǎo)致 mRNA的不能翻譯，從而篩選陽性克隆子。如果透明圈不明顯，還可往培養(yǎng)板上噴碘，使淀粉所在區(qū)域呈藍(lán)色本底，易于辨認(rèn)。由于在一般的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)規(guī)模下，每個(gè)受體細(xì)胞最多只能接受一個(gè)載體分子，因此轉(zhuǎn)化率的定義也可以表征為：每 微克 載體 DNA轉(zhuǎn)化后，受體細(xì)胞接納 DNA的個(gè)數(shù)，即克隆數(shù)（在篩選時(shí)，未接納載體或重組子的受體細(xì)胞不長）B 轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率的定義 例如， pUC18對大腸桿菌的轉(zhuǎn)化率為 108，即每微克 pUC18中只有 108個(gè)分子能進(jìn)入受體細(xì)胞。 539。 539。其原理是：載體分子上攜帶某種顯色酶基因，其表達(dá)產(chǎn)物能使細(xì)胞產(chǎn)生顏色反應(yīng)，從而易于辨認(rèn)和挑選，如大腸桿菌質(zhì)粒 pUC18攜帶的 lacZ’基因（藍(lán)色反應(yīng)）、鏈霉菌質(zhì)粒pIJ702攜帶的 melC基因（黑色反應(yīng)）等A載體遺傳標(biāo)記檢測顯色篩選法顯色篩選法的基本操作： pUC18AprlacZ39。 分離的基因編碼著豐富的 mRNA。因此， 目的重組子 菌落周圍會(huì)形成透明圈。在強(qiáng)大電場的作用下，細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜產(chǎn)生縫隙，質(zhì)粒或 DNA重組分子便可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi) 電穿孔轉(zhuǎn)化法操作簡單，而且?guī)缀鯇λ泻?xì)胞壁結(jié)構(gòu)的受體細(xì)胞均有效，但轉(zhuǎn)化效率差別很大 同樣的原理，電穿孔法也可用于質(zhì)粒消除實(shí)驗(yàn)B 轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率的定義 轉(zhuǎn)化率是衡量轉(zhuǎn)化效率的重要指標(biāo)，其定義為：每 微克 載體DNA在最佳轉(zhuǎn)化條件下進(jìn)入受體細(xì)胞的分子數(shù)。F重組率提高重組率的方法 提高外源 DNA片段與載體的分子比 ： 5 : 1 10 : 1 載體 DNA分子在連接前先除去磷酸基團(tuán)： 539。 AATTCG539。oriAp + Xgal重組子（ Apr + lacZ） 將外源基因克隆在 pUC18的 lacZ’標(biāo)記 基因內(nèi)部，使之滅活，此時(shí)重組子呈 Apr、 lacZ， 淡黃色菌落；而非重組子則呈 Apr、 lacZ+， 藍(lán)色菌落 B克隆 DNA序列檢測限制性酶切圖譜法 所謂的限制性酶切圖譜法就是對載體上插入的外源 DNA片段進(jìn)行酶切圖譜分析，并以此與目的基因的已知圖譜對比，因此利用這種方法不僅能區(qū)分 重組子 與非重組子，而且還能鑒定 目的重組子 。 優(yōu)點(diǎn) ：不需要克隆基因的表達(dá)，不需要探針或抗體。將待鑒定的重組克隆涂布在此培養(yǎng)基上，含目的基因的 目的重組子 可其表達(dá)的淀粉酶分泌出胞外，并均勻擴(kuò)散，同時(shí)降解淀粉為可溶性的多糖或單糖。再生在特殊的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行，內(nèi)含脯氨酸和微量元素 A轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)l噬菌體 DNA的轉(zhuǎn)染 感受態(tài)細(xì)胞的培養(yǎng)： 將大腸桿菌在含有麥芽糖（不含葡萄糖）和 MgCl2的培養(yǎng)基 中培養(yǎng)至 OD600 = 吸附： 加入經(jīng)體外包裝好的重組噬菌體懸浮液， 30℃ 保溫 10分鐘轉(zhuǎn)染裂解： 加入 20倍體積的新鮮培養(yǎng)基， 30℃