色譜分離技術(shù)ppt課件(2)-資料下載頁(yè)
2025-05-04 12:06本頁(yè)面
【正文】 正相色譜的流出順序是極性小的先流出，極性大的后流出；反相色譜的流出順序正好相反。 正相色譜的特點(diǎn) 反向色譜的特點(diǎn) 介質(zhì) ? 正相色譜常采用氰基柱、氨基柱、硅膠柱和二醇基柱。 ? 反向色譜介質(zhì)的代表為具非極性分子層的硅膠體系。 流動(dòng)相的選擇 ? 極性 ? 回收利用 ? 不干擾檢測(cè) ? 洗脫方式 應(yīng)用 正相色譜： ? 提純紫杉醇 ? 手性拆分 反向色譜： ? 乳制品有機(jī)酸分析 ? 植物油中維生素分析 ? 分離黃酮類物質(zhì) 疏水色譜 ? 利用蛋白質(zhì)上的疏水基團(tuán)或區(qū)域在一個(gè)疏水作用體系中，與介質(zhì)上的疏水基團(tuán)作用，達(dá)到吸附平衡，然后在一定條件下，解吸達(dá)到分離目的。 ? 其原因是蛋白質(zhì)和配基疏水基團(tuán)周圍水分子的重排和置換。 ? 利用樣品中各組份與色譜填料上配基 相互作用力的差異 , 在洗脫時(shí)由于各組份 移動(dòng)速度的不同 而達(dá)到分離的目的 . 配基通常是一些疏水性基團(tuán) , 如丁基、苯基等 . ? 蛋白質(zhì)表面多由親水性基團(tuán)組成 , 也有一些由疏水性較強(qiáng)的氨基酸組成的 疏水性區(qū)域 .不同種類蛋白質(zhì)的表面疏水性區(qū)域多少不同 ,疏水性強(qiáng)弱也不同 。對(duì)于同一種蛋白質(zhì)在不同介質(zhì)中 ,其疏水性區(qū)域伸縮程度也不同 ,從而使疏水性基團(tuán)暴露的程度呈現(xiàn)出一定的差異。 ? 疏水相互作用色譜法正是利用鹽 水體系中樣品組份的疏水性基團(tuán)和色譜填料的疏水性配基相互作用力的不同而使樣品組份得以分離的 . 介質(zhì)制備 ? 以瓊脂糖和硅膠等為主體，引入丁基和苯基等疏水配基。 ? 配基碳數(shù)越多，疏水作用力越大，吸附容量也越大，但解析越難。 丁基 苯基 辛基 影響因素 ? 配基種類和密度 ? 鹽 種類和濃度 的影響 有些鹽 (如 Na2SO4, (NH4)2SO4等 )可以提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性 , 使其溶解度下降 , 對(duì)蛋白質(zhì)有鹽析效應(yīng) , 使蛋白質(zhì)與固定相的 疏水作用增強(qiáng) 。 有些鹽 (如 MgCl2) 雖然能增加溶劑表面張力 , 但同時(shí)也增加蛋白質(zhì)的溶解度 , 并不能增強(qiáng)蛋白質(zhì)與色譜填料的相互作用 . 鹽的種類不同 , 不僅影響著蛋白質(zhì)在色譜柱上的保留行為 , 同時(shí)也影響著蛋白質(zhì)分離純化的效果 . ? 平衡液及樣品中的高鹽濃度能促進(jìn)蛋白質(zhì)與配基的相互作用，在一定鹽濃度范圍之內(nèi) , 蛋白質(zhì)的吸附量與鹽濃度成線性關(guān)系。 ? 被吸附的蛋白質(zhì)可以通過(guò)降低鹽濃度而被洗脫下來(lái)。 鹽濃度越高，吸附容量越大； 鹽析效果越顯著，影響越大 ? pH 對(duì)疏水色譜的影響 pH 的改變必然改變蛋白質(zhì)的電荷性質(zhì)及電荷量，從而影響蛋白質(zhì)與色譜填料間的靜電相互作用，也影響蛋白質(zhì)在色譜柱上的保留行為。 由于每一種蛋白質(zhì)在某一特定 pH 條件下，其空間構(gòu)象、所帶電荷情況不一致，因此， pH 對(duì)蛋白質(zhì)在色譜柱上保留行為的影響具有一定的復(fù)雜性。某些情況下影響較小，有時(shí)改變 pH可促進(jìn)洗脫。 ? 柱溫對(duì)疏水色譜的影響 疏水相互作用是一吸熱過(guò)程，增加溫度可以提高蛋白質(zhì)與配基間疏水相互作用力；因此，增加柱溫有利于蛋白質(zhì)的吸附，保留值增加；但同時(shí)溫度上升易使蛋白質(zhì)變性失活。 ? 添加劑對(duì)疏水色譜的影響 在疏水色譜的洗脫液中有時(shí)要加入一些添加劑、去污劑等。它們可以通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合到疏水配基上，而使結(jié)合在柱上的蛋白質(zhì)更易被洗脫下來(lái)。 疏水色譜的解吸可以采取哪些方法 降低離子強(qiáng)度 增加 |pH – pI| [乙二醇 ] or [I] [表面活性劑 ] 洗脫方法 疏水色譜的應(yīng)用 ? 疏水色譜與其它分離技術(shù)聯(lián)合分離蛋白質(zhì) ? 單獨(dú)分離純化某些蛋白質(zhì) ? 分析蛋白質(zhì)構(gòu)象變化 ? 工業(yè)中的大規(guī)模分離 疏水色譜應(yīng)用的特點(diǎn) 1 互補(bǔ)工具： HIC主要用于蛋白質(zhì)類分離純化 ， 雖然 HIC不如IEC的應(yīng)用廣泛 ， 但可以作為 IEC的互補(bǔ)工具 。 如方法得當(dāng) ，HIC與 IEC的分離效率相當(dāng) 。 2 與鹽析銜接：由于在高濃度鹽溶液中疏水性較大 ， 因此 HIC可直接分離鹽析后的蛋白質(zhì)溶液 。 3 可以通過(guò)調(diào)節(jié)疏水性配基鏈長(zhǎng)和密度來(lái)控制吸附性能的大小 ，因此可根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物的性質(zhì)選擇適當(dāng)?shù)奈絼?。 4 疏水性吸附介質(zhì)的種類多 ， 選擇余地大 ， 價(jià)格與離子交換劑相當(dāng) 。 共價(jià)色譜 ? 共價(jià)色譜是將含有二硫鍵的配基固定在色譜介質(zhì)上，利用蛋白質(zhì)表面的硫醇基團(tuán)與二硫鍵通過(guò)可逆的化學(xué)結(jié)合，以吸附蛋白質(zhì)。 ? 無(wú)硫醇基團(tuán)的蛋白質(zhì)分子通過(guò)色譜柱先流出 ? 吸附的蛋白質(zhì)解吸后得到分離 ? 該技術(shù)主要用于含有硫醇或雙硫鍵的蛋白質(zhì)或多肽的分離純化。 介質(zhì)合成 ? 谷胱甘肽法 ? 環(huán)氧化物法 吸附和解吸 ? 在初步了解待分離物硫醇含量和介質(zhì)吸附容量的基礎(chǔ)上進(jìn)行 ? 選用較長(zhǎng)層析柱，緩慢通過(guò)柱子 ? 之后選用小分子硫醇物質(zhì)進(jìn)行洗脫 ? 分離蛋白質(zhì)和硫醇物 ? 凝膠再生 應(yīng)用 ? 分離半胱氨酸 ? 分離含有半胱氨酸的多肽 ? 分離含 SH的蛋白質(zhì)或肽段
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