《dna分離技術(shù)》ppt課件-文庫(kù)吧
2024-12-22 14:02 本頁(yè)面
【正文】 一步法 : ，加 200μl ，取 60μl研磨液，加 300μl 100mol/l TrisHCL（ PH ）緩沖液中 8000rpm離心 5min，取上清即為DNA提取液。 2．以 DNA提取液 /去離子水 1/100的比例加入石英杯中在蛋白質(zhì)核酸分析儀中進(jìn)行測(cè)定。 基因組 DNA－ SDS法 基因組 DNA－其它方法 ? 物理方式 ：玻璃珠法、 超聲波法、研磨法、凍融法 ? 化學(xué)方式 ：異硫氰酸胍法、堿裂解法 ? 生物方式 ：酶法 ? 根據(jù)細(xì)胞裂解方式的不同有： 基因組 DNA－其它方法 ? 吸附材料結(jié)合法： ? 根據(jù)核酸分離純化方式的不同有： ? 硅質(zhì)材料 ? 陰離子交換樹(shù)脂 ? 磁珠 高鹽低 pH值結(jié)合核酸，低鹽高 pH值洗脫。 快捷高效。 低鹽高 pH值結(jié)合核酸，高鹽低 pH值洗脫。 適用于純度要求高的實(shí)驗(yàn)。 磁性微粒掛上不同基團(tuán)可吸附不同的目的物，從而達(dá)到分離目的。 基因組 DNA－其它方法 ? 濃鹽法 ： ? 有機(jī)溶劑抽提法： ? 密度梯度離心法： 利用 RNA和 DNA在鹽溶液中溶解度不同，將二者分離 有機(jī)溶劑作為蛋白變性劑，同時(shí)抑制核酸酶的降解作用 利用不同內(nèi)容物密度不同的原理分離各種內(nèi)容物 質(zhì)粒 DNA－堿裂解法 ? 堿裂解法原理 ? 染色體 DNA比質(zhì)粒 DNA分子大得多，且染色體 DNA為 線狀分子，而質(zhì)粒 DNA為共價(jià)閉合環(huán)狀分子； ? 當(dāng)用堿處理 DNA溶液時(shí)，線狀染色體 DNA容易發(fā)生變性，共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒 DNA在回到中性 pH時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象； ? 變性染色體 DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒 DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過(guò)離心將兩者分開(kāi)。 ? 堿變性 質(zhì)粒 DNA－堿裂解法 ? 堿裂解法流程圖 對(duì)數(shù)期菌體 溶液 III中和 溶液 I充分重懸 溶液 II裂解 上清液 抽提 離心洗滌 酒精沉淀 干燥溶解 沉淀 質(zhì)粒 DNA溶液 溶液配制： 溶液 1－ GET緩沖液： 50mmol/L葡萄糖 ， 10mmol/L EDTA， 25mMTrisHCl 。 溶液 2－ , 1%SDS 溶液 3－乙酸鉀溶液 (3M, pH=)： 60mL的 5mol/L KAc, ， H2O TE緩沖液或水 （ + 20?g/ml RNase ） : 10mmol/L， TrisHCl, 1mmol/L， EDTA ， , 100%乙醇 ， 70％ 乙醇 注意： ? 用移液器操作時(shí)，每一步都要格外小心，特別是在加入溶液 II 和III后，一定不要?jiǎng)×艺袷?，以免切?DNA(包括質(zhì)粒 DNA和基因組DNA)！?。? 1. 培養(yǎng)細(xì)菌：將帶有質(zhì)粒的大腸桿菌接種到 ，37℃ 培養(yǎng) 12～ 16小時(shí) 。 2. 取液體培養(yǎng)液 Eppendorf管中 ，10000r/min離心 1min， 去掉上清液 ， 加入100?l溶液 1(GET) ， 充分混勻放置 35分鐘 。 3. 加入 200?l新配制的 +1％ SDS（ 變性液 ） ， 加蓋顛倒 67次使之混勻 ， 冰上放置 5min。 質(zhì)粒小量提取的方法（手工提?。? 4. 加入 150 ? l乙酸鉀溶液 (溶液 II)，加蓋后顛倒 67次混勻，冰上放置 5min。 5. 用臺(tái)式高速離心機(jī)， 10000r/min離心 7min，上清移入另一干凈離心管，并加 1ml 100％乙醇混勻， 12022r/min離心 5min，棄去上清液 。 6. 沉淀用 70％乙醇清洗一次， 12022r/min離心 5min，棄去上清液，小管倒置于吸水紙上，除盡乙醇，室溫自然干燥 。 7. 加入 3050?l含有 20?g/ml RNase的滅菌蒸餾水或 TE 緩沖液溶解提取物，室溫放置 1530min，使 DNA充分溶解 (有時(shí)需要酚 :氯仿抽提 )。 8. 將分離出的質(zhì)粒 DNA置于 20℃ 保存?zhèn)溆谩? 用分光光度計(jì)法定量 DNA 2?l提取的質(zhì)粒 DNA， 加入 98?l蒸餾水對(duì)待測(cè) DNA樣品做 1:50(或更高倍數(shù)的稀釋 )。 ,在波長(zhǎng) 260nm、280nm處調(diào)節(jié)紫外分光光度計(jì)讀數(shù)至零 。 3. 加入 DNA稀釋液 ， 測(cè)定 260nm 及 280nm的吸收值 。 260nm 讀數(shù)用于計(jì)算樣品中核酸的濃度 。 4. OD260值為 1相當(dāng)于約 50?g /ml雙鏈 DNA，33?g /ml單鏈 。 5. 可根據(jù)在 260nm以及在 280nm的讀數(shù)的比值 （ OD260/OD280） 估計(jì)核酸的純度 。 一般DNA的純品 ， 其比值為 ， 低于此值說(shuō)明有蛋白質(zhì)或其它雜質(zhì)的污染 。 記錄 OD值，通過(guò)計(jì)算確定 DNA濃度或純度，公式如下 : dsDNA=50 (OD260) 稀釋倍數(shù) 以上濃度單位為 ?g /ml 凝膠電泳檢測(cè) DNA的濃度 %的瓊脂糖凝膠，100V,40分鐘。 ?NEB 標(biāo)準(zhǔn)分子量片段(1kb DNA Ladder) 1 kb DNA Ladder雖然不能對(duì) DNA質(zhì)量進(jìn)行精確定量分析，但可以通過(guò)與相近的條帶進(jìn)行比較估算出大概的數(shù)據(jù)。每條帶大概的量如下（按 上樣量計(jì)。應(yīng)按 13條帶計(jì)算，因?yàn)?3kb的量是其它片段量的近三倍）： 片段 堿基對(duì) 質(zhì)量 1 10,002 42 ng 2 8,001 42 ng 3 6,001 50 ng 4 5,001 42 ng 5 4,001 33 ng 6 3,001 125 ng 7 2,000 48 ng 8 1,500 36 ng 9 1,000 42 ng 10a 517 42 ng* 10b 500 42 ng* 的條帶由 500bp和 517bp組成，這樣即使在低分子量區(qū)域條帶的強(qiáng)度也比較均一。 質(zhì)粒 DNA－煮沸法 ? 煮沸法原理 ? 染色體 DNA比質(zhì)粒 DNA分子大得多，且染色體 DNA為 線狀分子，而質(zhì)粒 DNA為共價(jià)閉合環(huán)狀分子； ? 當(dāng)加熱處理 DNA溶液時(shí)，線狀染色體 DNA容易發(fā)生變性，共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒 DNA在冷卻時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象； ? 變性染色體 DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒 DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過(guò)離心將兩者分開(kāi)。 細(xì)胞器 DNA－差速離心法 ? 差速離心法原理 ? 是利用物質(zhì)比重的不同分離混合物的一種方法。 ? 將待分離物質(zhì)置于均勻介質(zhì)（蔗糖）中，以一定的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心，比重大的物質(zhì)優(yōu)先沉降，比重小的卻處于上層，從而得以分離。 線粒體和葉綠體是生物體內(nèi)半自主性細(xì)胞器，自身可編碼蛋白，它們的 比重和大小一定，因而在同一離心場(chǎng)內(nèi)的沉降速度也一定，根據(jù)這一原理，常用不同轉(zhuǎn)速的離心法，將細(xì)胞內(nèi)各
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