離心分離技術(shù)ppt課件-資料下載頁
2025-05-01 22:13本頁面
【正文】 梯梯度： 用手工由底部向上分層加入漸濃的介質(zhì)溶液 ， 由于擴散作用可自然形成連續(xù)梯度 。 擴散時間還受溫度 、 階梯厚度 、階梯密度差的影響 。 (2) 混合梯度法： 借助梯度混合儀或自動梯度儀 ， 可自動調(diào)節(jié)梯度斜率 、形狀 、 濃度 ， 還可同時制備幾個梯度 。 制成的梯度放置過久 ，梯度形狀 、 斜率會變化 。 梯度混合器 三種梯度形成示意圖 a 線性梯度 b 凸形梯度 c 凹形梯度 High density solution Low density solution 自形成梯度 ：（ 3） 離心平衡法 自形成梯度的等密度離心 (平衡等密度離心 )。平衡等密度離心常用的梯度介質(zhì)有離子型 鹽類如鉛鹽或銣鹽和三碘化苯衍生物等 。離心時是把密度均一的介質(zhì)溶液和樣品混合后裝入離心管中，通過離心自形成梯度，讓粒子在梯度中進行再分配。離心達到平衡后，不同密度的粒子在梯度中各自分配到其等密度點的特定位置上，形成不同的區(qū)帶。 四 、 離心操作 (一 )加樣和離心： 1. 樣品準備 ： ? 離心前先除去樣品中大顆粒和膠狀不溶物 。 ? 要求樣液密度 梯度最大值 （ 速度區(qū)帶離心 ） 。 o 樣液中含有低濃度鹽 （ 如 NaCl） 可消除組分顆粒間電荷影響 （ 減慢速度降低分辨率 ） 。 o 樣品中需加緩沖劑或保護劑 ， 如酶底物 、 EDTA等或 Ca2+、Mg2+離子 。 2. 加樣 ： ?頂部加樣 —— 沉降差速區(qū)帶離心； ?底部加樣 —— 漂浮差速區(qū)帶離心； ?中部加樣 —— 平衡等密度離心 （ 等密度區(qū)帶離心 ） ； ?混合加樣 —— 平衡等密度離心； ? 差速區(qū)帶離心：樣品須少 （ 5%梯度總體積 ） ， 樣品不太濃 （ 90%梯度最小濃度 ） 。 嚴格按使用說明操作。 ? 樣品管要充滿且配平； ? 超離心須在低溫 、 真空下進行； ? 加速 、 減速須緩慢； ? 防止擾動梯度和區(qū)帶 ， 降低分辨率； ? 平衡等密度離心時 ， 轉(zhuǎn)速不能過高 。 ： (二 ) 梯度的回收 1. 底部收集法 （ 穿刺法 ） ： 用一根金屬空心針從離心管底刺人管內(nèi) ， 不同區(qū)帶內(nèi)的組分自下而上地先后從針管內(nèi)分別流出 ， 然后用部分收集器分別收集 。 從高密度開始收集 。 2. 頂部收集法： 不破壞離心管 。 o取代法： o 向上取代法：注入高密度液體； o 向下取代法：注入低密度液體。 o虹吸法：靠負壓依次吸取梯度液 。 3. 切割法： 粘度大時上述方法不適用 。 凍結(jié)切割法； 聚合切割法 。 (三）梯度分析 : 測定梯度濃度意義 梯度測定法 樣品測定 （四）離心制備的步驟 : 組織 勻漿 過濾 分級離心 梯度離心 （五）制備超離心注意事項 : 注意平衡 查閱目的物信息 超離心設(shè)備 美國 BECKMAN（ J6系列） 超高速離心機 離心操作的注意事項 高速與超速離心機是生化實驗教學和生化科研的重要精密設(shè)備，因其轉(zhuǎn)速高，產(chǎn)生的離心力大，使用不當或缺乏定期的檢修和保養(yǎng)，都可能發(fā)生嚴重事故，因此使用離心機時都必須嚴格遵守操作規(guī)程。 超速冷凍離心機 :未經(jīng)過培訓和考核者不能使用。 其它普通離心機：按照操作要求進行。 ，必須事先在天平上 精密地平衡離心管和其內(nèi)容物 ，平衡時重量之差不得超過各個離心機說明書上所規(guī)定的范圍，每個離心機不同的轉(zhuǎn)頭有各自的允許差值， 轉(zhuǎn)頭中絕對不能裝載單數(shù)的管子 ，當轉(zhuǎn)頭只是部分裝載時， 管子必須互相對稱地放在轉(zhuǎn)頭中 ，以便使負載均勻地分布在轉(zhuǎn)頭的周圍。 孔內(nèi)有無異物 。 。轉(zhuǎn)頭在使用前應放置在冰箱或置于離心機的轉(zhuǎn)頭室內(nèi) 預冷 。 ，要根據(jù)各種離心機的具體操作說明進行，根據(jù)待離心液體的性質(zhì)及體積選用適合的離心管，有的離心管無蓋，液體不得裝得過多，以防離心時甩出，造成轉(zhuǎn)頭不平衡、生銹或被腐蝕，而 制備性超速離心機的離心管 ，則常常要求必須將液體裝滿，以免離心時塑料離心管的上部凹陷變形。每次使用后，必須仔細檢查轉(zhuǎn)頭，及時清洗、擦干，轉(zhuǎn)頭是離心機中須重點保護的部件，搬動時要小心，不能碰撞，避免造成傷痕，轉(zhuǎn)頭長時間不用時，要涂上一層上光臘保護，嚴禁使用顯著變形、損傷或老化的離心管。 不得隨意離開 ，應隨時觀察離心機上的儀表是否正常工作，如有異常的聲音應立即停機檢查，及時排除故障。 ，使用轉(zhuǎn)頭時要查閱說明書， 不得過速使用 。每一轉(zhuǎn)頭都要有一份使用檔案，記錄累積的使用時間，若超過了該轉(zhuǎn)頭的最高使用限時，則須按規(guī)定降速使用。 ，不準用手停止轉(zhuǎn)頭。
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