【文章內(nèi)容簡介】 據(jù)，另一部分空間為流動相所占據(jù)。這后一部分空間稱為塔板體積（ ?Vm）。流動相從柱入口以一個個 ?Vm 體積， 脈沖式 地加入。 ③組分在每塊塔板上的兩相間瞬時達到平衡。 ④分配系數(shù)在所有塔板上都為常數(shù)，與組分濃度無關(guān)即相當于線性等溫線的情況。 ⑤忽略塔板間的縱向分子擴散。 ? 流出曲線 經(jīng) N次平衡后，流動相中的組分分數(shù) q與在固定相組分分數(shù) p符合二項式分布： （ p+q） N 上例中 K=1， p=q=1/2， 展開為： （ p+q） 4=p4+4qp3+6q2p2+4q3p+q4 =1/16+1/4+3/8+1/4+1/16 若 K=2， p=， q=， 則 （ p+q）4=++++ 當 N≥50時，流出曲線對稱呈正態(tài)分布。 進流動相 平衡 K=1 1/4 2/4 1/4 1/8 3/8 3/8 1/8 1/2 1/16 188。 3/8 188。 1/16 ? 柱效 n =（ tR/W1/2） 2 =16（ tR/W） 2 neff=（ tR’/W1/2） 2=16（ tR’/W） 2 Heff=L/Neff ? 分配色譜與精餾的差別 速率理論 Rate Theory ? 塔板理論滿意地解釋了色譜流出曲線呈高斯分布；論證了組分的保留值與分配系數(shù)間的關(guān)系；并能成功地用于塔板數(shù)的計算。 ? 塔板理論的局限性 ? 塔板理論作了五個不符合實際的假設(shè)。它還排除了一個極其重要的參數(shù) —— 流動相速度，并忽略了兩相體積的大小。由于排除了流動相速度這一參數(shù)，因而不能解釋在不同流動相速度時的柱效不同的原因。 從本質(zhì)上說，塔板理論的缺點在于忽視了組分分子在兩相中擴散和傳質(zhì)的動力學過程。 ? 色譜過程中的擴散和傳質(zhì) ? 對速率理論作出全面解釋的是荷蘭化學家 Van Deemter等，以后又由美國化學家 J. Calvin Giddings作了進一步的改進。 ? 當組分的譜帶向柱出口遷移時，在非理想線性色譜狀態(tài)下必然要展寬。 ? 在柱內(nèi)有四種受動力學控制的過程，使譜帶偏離理想狀態(tài)而展寬。 ? 這四種過程是渦流擴散、縱向分子擴散、流動相中傳質(zhì)和固定相中傳質(zhì)。 ? 渦流擴散 eddy diffusion ? 當組分隨流動相向柱出口遷移時，流動相由于受到固定相顆粒的障礙，不斷改變方向，使組分分子在前進中形成紊亂的類似 “ 渦流 ” 的流動，導致譜帶展寬，故稱渦流擴散。 ? 由 渦流 擴散引起的展寬程度可表示為： ?2e=2?dpL ?為填充不規(guī)則因子，它決定于固定相顆粒的直徑 dp、粒度范圍和填充情況； L為柱長。 ? 縱向分子擴散 longitudinal diffusion 縱向分子擴散指沿 x軸方向的擴散，它是由濃度梯度造成的。由縱向分子擴散引起的展寬程度可表示為： ?2l=2?DmL/u ?為彎曲因子，亦稱阻礙因子，它反映固定相顆粒的幾何形狀對自由分子擴散的阻礙情況，一般小于 1； u為流動相線速； Dm為組分在流動相中的擴散系數(shù)。 Dm?1/√M。 同一組分在氫氣中的擴散系數(shù)要大于在氮氣中的擴散系數(shù)，因此用氫氣作流動相對，縱向分子擴散更嚴重。 ? 流動相中傳質(zhì)阻力 組分從流動相主體擴散到流動相與固定相的界面，以便發(fā)生相轉(zhuǎn)移，妨礙這一擴散過程的阻力稱為流動相傳質(zhì)阻力。由流動相傳質(zhì)阻力所引起的展寬程度可表示為： ?2m= ?dp2Lu/Dm ?是由柱填充性質(zhì)決定的因子，與固定相性質(zhì)及構(gòu)型有關(guān)。 dp為固定相顆粒的平均直徑。 影響展寬的因素有： dp、 u、 Dm、 L ? 固定相中傳質(zhì)阻力 組分到達兩相界面后，就要擴散到固定相內(nèi)部達到分配平衡，然后又返回兩相界面。妨礙這一過程的阻力稱為固定相傳質(zhì)阻力。由固定相中傳質(zhì)阻力引起的譜帶展寬程度可表示為： ?2s= qk’df2Lu/（（ 1+k’） 2Ds） q 是與固定相性質(zhì)、構(gòu)型有關(guān)的因子，對均勻液膜， q為 2/3； k’為分配比。 df為固定液的平均厚度。 Ds為組分在固定相中擴散系數(shù)。 影響 ?2s 因素有： df、 Ds、 u、 L、 k’ 對于吸附色譜，其分配平衡受吸附 解吸動力學速率控制， 固定相中傳質(zhì)阻力引起的譜帶展寬程度可表示為： ?2sa= 2k’Lu/（（ 1+k’） 2Kd） Kd為吸附速率常數(shù)。 ? 速率理論方程式 H= ?2/L= ?2e+ ?2l+ ?2m+ ?2s = 2?dp+2?Dm/u+?dp2u/Dm+qk’df2u/((1+k’)2Ds) H=A+B/u+Cu 這里 A— 渦流擴散相 B— 縱向擴散相 C— 傳質(zhì)阻力相 吸附色譜 ? 吸附色譜的一般操作 ? 羥基磷灰石色譜 ? 疏水作用色譜 ? 金屬螯合色譜 ? 共價作用色譜 ? 吸附劑（固定相）對不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物分離的。 ? 無機基質(zhì) 吸附色譜 （多種作用力） ? 疏水作用吸附色譜 （疏水作用） ? 共價作用吸附色譜 （共價鍵） ? 金屬螯合作用吸附色譜 （螯合作用） ? 離子交換色譜和親和色譜 也可歸類于吸附色譜。 吸附色譜的一般操作 ? 吸附劑的選擇 ? 按化合物的種類可分成無機基質(zhì)色譜填料和有機基質(zhì)色譜填料兩大類； ? 按形狀可分成球形和無定形兩類； ? 按硬度可分成硬質(zhì)色譜填料、半硬質(zhì)疑膠色譜填料及一些如瓊脂糖的生物軟膠； ? 按結(jié)構(gòu)可分成表面多孔薄殼色譜填料和全多孔色譜填料兩類。 ? 裝置 ? 一般由進樣、流動相供給、色譜柱、檢測及流分收集器等部分構(gòu)成 。 ? 流動相供給部分 ? 一般包括貯液罐、高壓泵、液體混合室及梯度洗脫系統(tǒng)。 ? 檢測器 ? 根據(jù)組分的物理化學特性 ， 例如紫外吸收 、熒光性 、 電導率 、 旋光性以及可見光光密度等 ， 進行在線檢測 。 ? 流分收集器 ? 是將柱后流出的液體 ， 定時定量分別收集的儀器 。 有滴數(shù)式 、 容量式 、 質(zhì)量式等若干種 。 羥基磷灰石色譜 ? 羥基磷灰石（ hydroxyapatite， HAP）是一種磷酸鈣晶體，基本分子結(jié)構(gòu)為Ca10(PO4)6(OH)2。 ? HAP的吸附主要基于鈣離子和磷酸根離子的靜電引力，即在 HAP晶體表面存在兩種不同的吸附晶面，分別起陰、陽離子交換作用。 ? A W K Tiselius et al于 1956年提出。 ? 1956年 Tiselius型羥基磷灰石用于蛋白質(zhì)分離 ? 1986年后出現(xiàn)了高效化的商品球形 HAP吸附劑，如 BioRad、 Sigma、 高研（ Koken）、旭光學（ Asashi Optical ） 、東壓燃料工業(yè)（ Toatsu） 等公司均有產(chǎn)品出售。 ? 由于 HAP晶體表面結(jié)構(gòu)特別，吸附機理特殊，可用于識別 DNA及 RNA的單鏈和雙鏈。 ? 可分離 IEC和 HIC難于分離的蛋白質(zhì)體系。 ? HAP色譜通常以磷酸鹽緩沖液為流動相，采用提高鹽濃度的線性梯度脫法。 ? 在中性 pH環(huán)境下酸性蛋白質(zhì)（ pI＜ 7 ）主要吸附于 C點，堿性蛋白質(zhì)（ pI＞ 7）主要吸附于 P點。利用磷酸鹽緩沖液（ K2HPO4＋ KH2PO4）為流動相洗脫展開時，磷酸根離子在 C點競爭性吸附，交換出酸性蛋白質(zhì)，而 K＋ 在 P點競爭性吸附，交換出堿性蛋白質(zhì)。 ? HAP吸附劑價格便宜，遠低于離子交換劑，適用于大規(guī)模分離純化過程，已成為單克隆抗體的主要純化手段。 ? 如人腫瘤壞死因子 （ human tumour necrosis factor， hTNF） 利用 HAP層 析可分離得到 4個 洗脫峰。 疏水作用色譜 ? 疏水作用色譜 （ hydrophob