【導(dǎo)讀】熟悉生物物質(zhì)的概念、種類和來(lái)源；了解分離純化技術(shù)及其基本原理；化的特點(diǎn)與一般步驟；生物分離純化技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)。胞與體液等中分離、純化生物產(chǎn)品的過程。、工藝流程盡量簡(jiǎn)單化；②易受微生物污染導(dǎo)致目標(biāo)產(chǎn)物失活或降解。③易受光照、氧氣等的作用導(dǎo)致其分子結(jié)構(gòu)改變。速凍、有機(jī)溶劑脫水或制成丙酮粉在低溫下保存。途不同可采用多種分離純化手段；離純化的效果和成本；精制工序易放在工藝流程的后段。程下游加工所用的設(shè)備、試劑的要求亦提高。預(yù)期結(jié)果的有文件明的一系列活動(dòng)。產(chǎn)物基本不經(jīng)過后處理而直接使用。前的生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)。以青霉素產(chǎn)品的出現(xiàn)為代表。這一時(shí)期的特點(diǎn)是產(chǎn)品類型多，分。子結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，對(duì)分離純化提出了更高要求。作技術(shù)被引進(jìn)生物工業(yè)。如乙肝疫苗、干擾素等一批對(duì)人類十分有益的高附加。大，推出新技術(shù)。

　　

【正文】 法 講授法 一、膜分離技術(shù) 膜分離的概念 利用膜的選擇性（孔徑大小），以膜的兩側(cè)存在的能量差作為推動(dòng)力，由于溶液中各組分透過膜的遷移率不同而實(shí)現(xiàn)分離的一種技術(shù)。 膜的概念 （ 1）在一種流體相間有一層薄的凝聚相物質(zhì)，把流體相分隔開來(lái)成為兩部分，這一薄 層物質(zhì)稱為膜。 （ 2）膜本身是均一的一相或由兩相以上凝聚物構(gòu)成的復(fù)合體 （ 3）被膜分開的流體相物質(zhì)是液體或氣體 （ 4）膜的厚度應(yīng)在 ，否則不能稱其為膜。 膜分離技術(shù)的類型和定義 膜分離過程的實(shí)質(zhì)是物質(zhì)透過或被截留于膜的過程，近似于篩分過程，依據(jù)濾膜孔徑大小而達(dá)到物質(zhì)分離的目的，故而可以按分離粒子大小進(jìn)行分類： （ 1）微濾：以多孔細(xì)小薄膜為過濾介質(zhì)，壓力為推動(dòng)力，使不溶性物質(zhì)得以分離的操作，孔徑分布范圍在 ~14μ m之間； （ 2）超濾：分離介質(zhì)同上，但孔徑更小，為 ~ μ m，分離推動(dòng)力仍為壓力差，適合于分離酶、蛋白質(zhì)等生物大分子物質(zhì)； （ 3）反滲透：是一種以壓力差為推動(dòng)力，從溶液中分離出溶劑的膜分離操作，孔徑范圍在 ~ μ m 之間；（由于分離的溶劑分子往往很小，不能忽略滲透壓的作用，故而成為反滲透）； （ 4）納濾：以壓力差為推動(dòng)力，從溶液中分離 300~1000 小分子量的膜分離過程，孔徑分布在平均 2nm； （ 5）電滲析：以電位差為推動(dòng)力，利用離子交換膜的選擇透過性，從溶液中脫除或富集電解質(zhì)的膜分離操作； 膜的分類 ?按孔徑大小：微濾膜、超濾膜、反滲透膜、納濾膜 ?按膜結(jié)構(gòu)：對(duì)稱性膜、不對(duì)稱膜、復(fù)合膜 ?按材料分：合成有機(jī)聚合物膜、無(wú)機(jī)材料膜 膜材料的特性 對(duì)于不同種類的膜都有一個(gè)基本要求： （ 1）耐壓：膜孔徑小，要保持高通量就必須施加較高的壓力，一般模操作的壓力范圍在 ~，反滲透膜的壓力更高，約為 1~10MPa （ 2）耐高溫 :高通量帶來(lái)的溫度升高和清洗的需要 （ 3）耐酸堿：防止分離過程中，以及清洗過程中的水解； （ 4）化學(xué)相容性：保持膜的穩(wěn)定性； （ 5）生物相容性：防止生物大分子的變性； （ 6）成本低； 各種膜材料 （ 1）有機(jī)高分子膜： 纖維素酯 膜、縮合系聚合物（聚砜類）、聚烯烴及其共聚物、脂肪族或芳香族聚酰胺類聚合物、全氟磺酸共聚物和全氟羧酸共聚物、聚碳酸酯； （ 2）無(wú)機(jī)多孔膜：陶瓷膜 膜組件 （ 1）管式 （ 2）中空纖維 （ 3）螺旋卷繞式 （ 4）平板式 共同的特點(diǎn) （ 1）盡可能大的膜表面積 （ 2）可靠的支撐裝置 （ 3）可引出透過液 （ 4）膜表面濃度差極化達(dá)到最小 超濾和反滲透 目的：將溶質(zhì)通過一層具有選擇性的薄膜，從溶液中分離出來(lái) 分離時(shí)的推動(dòng)力都是壓強(qiáng)，由于被分離物質(zhì)的分子量和直徑大小差別及膜孔結(jié)構(gòu)不同，其采用的壓強(qiáng)大小不同。 反滲透膜的操 作壓力高達(dá) 10 MPa 超濾和反滲透操作中的滲透壓 由于超濾和反滲透過程都是用一種半透膜把兩種不同濃度的溶液隔開（淡水或鹽水），因此都存在滲透壓。 滲透壓的大小取決于溶液的種類、濃度和溫度； 一般說(shuō)來(lái)，無(wú)機(jī)小分子的滲透壓要比有機(jī)大分子溶質(zhì)的滲透壓高得多。 滲透與反滲透 滲透是由于存在化學(xué)勢(shì)存在梯度而引起的自發(fā)擴(kuò)散現(xiàn)象。 溶液中水的化學(xué)勢(shì) 因此，通常情況下， ???o 其結(jié)果是水從純水一側(cè)透過半透膜向溶液側(cè)滲透，使后者的液位抬高。 ??? ln0 RT???0?溶液中水的活度 純水的化學(xué)勢(shì) 如果在溶液一側(cè)施加壓力 1P ，外界力做功使溶液中水的化學(xué)勢(shì)升高，則純水通過膜的滲透就會(huì)逐漸減小，并最終停止（條件？），此時(shí)的壓力差就是溶液的滲透壓 ? 。 當(dāng) ??? 01 PP 時(shí)，水將從溶液一側(cè)向純水一側(cè)移動(dòng)，此種滲透稱之為反滲透。 實(shí)現(xiàn)超濾和反滲透的條件 ?超濾 ： 需要增加流體的靜壓力，改變天然過程的方向，才可能發(fā)生含有低分子量化合物的溶劑流通過膜，此時(shí)的推動(dòng)力是流體靜壓力與滲透壓的壓差； ?反滲透 ： 過程類似于 超濾，只是純?nèi)軇┩ㄟ^膜，而低分子量的化合物被截留。因此，操作壓力比超濾大得多。 ?因此，超濾和反滲透通常又被稱之為 “強(qiáng)制膜分離過程 ”1超濾的基本方程 1納米膜過濾技術(shù) 介于反滲透與超濾膜之間，能截留有機(jī)小分子而使大部分無(wú)機(jī)鹽通過； 特點(diǎn)： （ 1）在過濾分離過程中，能截留小分子有機(jī)物，并可以同時(shí)透析除鹽，集濃縮與透析為一體； （ 2）操作壓力低 1電滲析技術(shù) 電滲析技術(shù)是在直流電場(chǎng)的作用下，由于離子交換膜的阻隔作用，實(shí)現(xiàn)溶液的淡化和濃縮，分離推動(dòng)力是靜電引力。 atmp ppp ?? 0atmp ppp ??? 0)( ?apLJ pw ??? 二、電泳 技術(shù) 電泳概念 Arne Tiselius——物理化學(xué)家、諾貝爾獎(jiǎng)金獲得者 定義 ——荷電的膠體粒子在電場(chǎng)中的移動(dòng)； 電泳決定于環(huán)繞每個(gè)離子的離子霧中的擴(kuò)散雙電層，離子尺寸越大、溶液中的離子強(qiáng)度越高時(shí)，電泳現(xiàn)象變得越明顯。因此，電泳現(xiàn)象中的表面電勢(shì)和雙電層的因素起著決定性的作用。 電泳的原理 蛋白質(zhì)、核酸、多糖等常以顆粒分散在溶液中，它們的凈電荷取決于介質(zhì)的 H+濃度或與其它大分子的相互作用。 帶電粒子在電場(chǎng)中的遷移方式主要依據(jù)分子尺寸大小和形狀、分子所帶電荷或分子的生物學(xué)與化學(xué)特性。 電泳遷移率 電泳遷移率（ mobility） :在電位梯度 E 的影響下，帶電顆粒在時(shí)間 t 中的遷移距離 d。 其單位是 cm2sec1 V1 電泳遷移率的不同提供了從混合物中分離不同物質(zhì)的基礎(chǔ) 電泳的大致分類 依據(jù)電泳原理，現(xiàn)有三種形式的電泳分離系統(tǒng) （ 1）移動(dòng)界面電泳（ moving boundary electrophoresis） （ 2）區(qū)帶電泳（ zone electrophoresis ） （ 3）穩(wěn)態(tài)電泳（ steady state electrophoresis ） 其中以區(qū)帶電泳為目前常用的電泳系統(tǒng)。 區(qū)帶電泳的主要技術(shù) 具有支持介質(zhì)的區(qū)帶電泳具有防止電泳過程中的對(duì)流和擴(kuò)散，可使被分離的成分得到最大分辨率的分離； Etdm ?? 區(qū)帶電泳中的常用技術(shù) 載體電泳：粉末電泳、紙電泳、凝膠電泳、聚焦電泳 無(wú)載體電泳：自由電泳、毛細(xì)管電泳 凝膠電泳 作為電泳支持介質(zhì)必須具有：化學(xué)惰性、不干擾大分子的電泳過程，化學(xué)穩(wěn)定性好、均勻、重復(fù)性好、電內(nèi)滲小等特性。 凝膠電泳的支持介質(zhì)： （ 1）聚丙烯酰胺凝膠（ polyacrylamide gel, PGA） 由丙烯酰胺和交聯(lián)劑 N， N’甲叉雙丙烯酰胺在引發(fā)劑和增速劑的作用下，聚合而成 ； （ 2）瓊脂糖凝膠： 從瓊脂中精制分離出的膠狀多糖，其分子結(jié)構(gòu)大部分是由 1，3 連接的β D 吡喃半乳糖和 1， 4 連接的 3， 6 脫水α D 吡喃半乳糖交替形成的； 丙烯酰胺的聚合 烯酰胺的聚合通常是由化學(xué)或光化學(xué)過程完成的，通常采用過硫酸銨、過硫酸鉀或核黃素（引發(fā)劑）來(lái)引發(fā)該過程；以 N，N， N’， N’四甲基乙二胺（ TEMED）為增速劑。 該引發(fā) 增速的催化系統(tǒng)實(shí)質(zhì)是自由基催化的氧化 還原過程。 丙烯酰胺的化學(xué)聚合是由過硫酸銨在堿性條件下，產(chǎn)生游離氧自由基引發(fā)單體丙烯酰胺成為自由基狀態(tài)，經(jīng)過一系列的自由基反應(yīng)得到的 聚合物； 影響聚合的主要因素 （ 1）引發(fā)劑和增速劑的濃度：濃度小易導(dǎo)致聚合速度慢；濃度過大則易導(dǎo)致電泳時(shí)的燒膠以及電泳帶的畸變；一般控制使聚合過程在 40~60 分鐘內(nèi)完成。 （ 2）系統(tǒng) pH 值：酸性條件、堿性條件均可，但仍然存在一個(gè)最佳 pH 值，以獲得最佳的聚合結(jié)果； （ 3）溫度：低溫下聚合導(dǎo)致凝膠變脆和混濁；適當(dāng)提高溫度可以是凝膠透明而有彈性； （ 4）分子氧：分子氧的存在會(huì)阻礙凝膠的化學(xué)聚合；抽氣 （ 5）系統(tǒng)純度：金屬離子會(huì)影響凝膠的聚合； 聚丙烯酰胺凝膠電泳中的分子篩效應(yīng) 在使用凝膠介質(zhì)的電泳中，由于電 泳介質(zhì)具有高粘度和高的 摩擦阻力，因此不僅可以防止對(duì)流，而且可以把擴(kuò)散減到最小。 凝膠中的大分子分離取決于它的電荷、尺寸和形狀 凝膠的這種用于分離不同尺寸分子的特性是由于它的尺寸篩分能力（ size sieving capacity），這種現(xiàn)象被稱為分子篩效應(yīng)（ molecular sieving effect） 1瓊脂糖凝膠的性能、結(jié)構(gòu)與特點(diǎn) （ 1）瓊脂糖凝膠孔徑較大， %瓊脂糖的孔徑為 800nm，可以分析百萬(wàn)道爾頓分子量的大分子，但分辨率較凝膠電泳低。 （ 2）機(jī)械強(qiáng)度高：可以在濃度 1%以下使用； （ 3）無(wú)毒； （ 4）染色、脫色程序簡(jiǎn)單，背景色較低； （ 5）熱可逆性； （ 6）生物中性：一般不與生物材料結(jié)合； （ 7）電內(nèi)滲（ EEO）大：對(duì)于對(duì)流電泳有益 1電泳系統(tǒng)的基本組成 （ 1）電泳槽：是凝膠電泳系統(tǒng)的核心部分，管式電泳槽、垂直板電泳槽、水平板電泳槽 （ 2）電源 :聚丙烯酰胺凝膠電泳 200~600V，載體兩性電解質(zhì)等電聚焦電泳 1000~2020V，固相梯度等電聚焦 3000~8000V （ 3）外循環(huán)恒溫系統(tǒng) :高電壓會(huì)產(chǎn)生高熱，需冷卻； （ 4）凝膠干燥器 :用于電泳和染色后的干燥； （ 5）灌膠模具：制膠， 玻璃板和梳子； （ 6）電泳轉(zhuǎn)移裝置：利用低電壓，大電流的直流電場(chǎng)，使凝膠電泳的分離區(qū)帶或電泳斑點(diǎn)轉(zhuǎn)移到特定的膜上，如 PVDF 膜 （ 7）電泳洗脫儀：回收樣品 （ 8）凝膠掃描和攝錄裝置：對(duì)電泳區(qū)帶進(jìn)行掃描，從而給出定量的結(jié)果。 1常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳 （ 1）原理 由于聚丙烯酰胺凝膠電泳（ PAGE）是多孔介質(zhì)，不僅能防止對(duì)流，把擴(kuò)散減少到最低；而且其孔徑大小與生物大分子具有相似的數(shù)量級(jí)，能主動(dòng)參與生物分子的分離，具有分子篩效應(yīng)。 因此，在使用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行蛋白質(zhì)分離時(shí)，在電 泳過程中不僅取決于蛋白質(zhì)的 電荷密度，還取決于蛋白質(zhì)的尺寸和形狀。 PAGE 可以用圓盤電泳、垂直電泳或水平電泳 （ 2）電泳前的準(zhǔn)備工作 緩沖系統(tǒng)的選擇 ： （ a）保證蛋白質(zhì)的溶解性能、穩(wěn)定性以及生物活性的保持； （ b）電泳時(shí)間和分辨率：從理論上講 PAGE 可以在任何 pH進(jìn)行，但實(shí)際上過酸或過堿的條件下將發(fā)生某種水解（脫酰胺）。因此， pH 應(yīng)限制在 3~10 之間。 緩沖系統(tǒng)的選擇原則是兩種標(biāo)準(zhǔn)的對(duì)立權(quán)衡 （ a）如果緩沖液的 pH 選擇在遠(yuǎn)離樣品中各種蛋白的等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)分子所帶電荷的密度大，電泳時(shí)間短，區(qū)帶細(xì)而窄； （ b）如果緩沖 pH 選擇在靠近被分 離樣品的一種或幾種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，則蛋白質(zhì)分子之間的電荷密度差別大，分辨率就高； 因此，常常選擇 pH ~ 的緩沖，常用的緩沖液有 Tris甘氨酸（ pH ~）， Tris硼酸 (pH ~)和 Tris醋酸（ pH ~） 凝膠濃度的選擇 由于 PAGE 電泳分離不僅取決于蛋白質(zhì)的電荷密度，而且取決于分子的大小、形狀。因此，凝膠的分子篩效應(yīng)（即凝膠的孔徑與電泳的分辨率、電泳速度）密切相關(guān)。 根據(jù)凝膠孔徑與被分離分子的大小和形狀，可以將凝膠分為： （ a）非排阻性凝膠（ unrestrictive gel） :濃度 ~%的瓊脂糖凝膠； （ b）排阻性凝膠（ restrictive gel）：濃度大于 1%的瓊脂糖凝膠和常規(guī) PAGE 凝膠濃度太大，孔徑小于樣品分子尺寸，電泳時(shí)蛋白質(zhì)分子不能進(jìn)入凝膠，樣品仍留在加樣位置； 凝膠濃度太小，孔徑太大，樣品中各種蛋白質(zhì)分子均隨緩沖液推進(jìn)，不能得到很好的分離； PAGE 的具體操作過程 制膠：確定凝膠配方（凝膠、引發(fā)劑、增速劑的濃度和緩沖液），使用灌膠模具灌膠； 樣品準(zhǔn)備：選擇合適的樣品緩沖液、確定合適的樣品濃度（ 1~2mg/L，考染），加樣（ 溴酚藍(lán)）； 電泳： 4~6 小時(shí)，待溴酚藍(lán)前沿到達(dá)陽(yáng)極底部； 檢測(cè)：紫外掃描或染色（考馬斯亮藍(lán) R250、銀染色 —靈敏度比考染高 100 倍、熒光探針）； 照相、凝膠干燥； 定量測(cè)定； 1 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳 十二烷基磺酸鈉 聚丙烯酰胺凝膠電泳 主要用于測(cè)定蛋白質(zhì)亞基分子量以及未知蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定； 特點(diǎn)：設(shè)備簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便、測(cè)定快速、重復(fù)性高、樣品無(wú)需純化。 （ 1） SDSPAGE 的原理 蛋白質(zhì)分子的解聚 SDS 是一種陰離子去污劑，作為變性劑和助溶性試劑，能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破 壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)；而強(qiáng)還原劑，如二硫蘇糖醇、β 巰基乙醇能使半胱氨酸殘基之間的二硫鍵斷裂。 因此，在樣品和凝膠中加入 SDS 和還原劑后，蛋白質(zhì)分子被解聚為組成它們的多肽鏈，解聚后的氨基酸側(cè)鏈與 SDS 結(jié)合后，形成帶負(fù)電的蛋白質(zhì) SDS 膠束，所帶電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了蛋白質(zhì)原有的電荷量，消除了不同分子間的