層析技術(shù)的應(yīng)用-文庫(kù)吧資料
2025-07-19 22:36本頁(yè)面
【正文】 方法（生物活性測(cè)定、免疫學(xué)測(cè)定等）確定圖譜中目的物的位置，并回收目的物。目的物的過(guò)早解吸，會(huì)引起區(qū)帶擴(kuò)散；而目的物的過(guò)晚解吸會(huì)使峰形過(guò)寬。②梯度的上限要足夠高，使緊密吸附的物質(zhì)能被洗脫下來(lái)。當(dāng)A1＝A2時(shí)為線性梯度，當(dāng)A1＞A2時(shí)為凹形梯度，A1＞A2時(shí)為凸形梯度。兩個(gè)容器放于同一水平上，第一個(gè)容器盛有一定pH的緩沖液，第二個(gè)容器含有高鹽濃度或不同pH的緩沖液，兩容器連通，第一個(gè)容器與柱相連，當(dāng)溶液由第一容器流入柱時(shí)，第二容器中的溶液就會(huì)自動(dòng)來(lái)補(bǔ)充，經(jīng)攪拌與第一容器的溶液相混合，這樣流入柱中的緩沖液的洗脫能力即成梯度變化。由于這種洗脫pH與離子強(qiáng)度的變化大，使許多洗脫體積相近的成分同時(shí)洗脫，純度較差，不適宜精細(xì)的分離。 洗脫：已結(jié)合樣品的離子交換前，可通過(guò)改變?nèi)芤旱膒H或改變離子強(qiáng)度的方法將結(jié)合物洗脫，也可同時(shí)改變pH與離子強(qiáng)度。為了達(dá)到滿意的分離效果，上樣量要適當(dāng)，不要超過(guò)柱的負(fù)荷能力?！ 、布訕优c洗脫加樣：層析所用的樣品應(yīng)與起始緩沖液有相同的pH和離子強(qiáng)度，所選定的pH值應(yīng)落在交換劑與被結(jié)合物有相反電荷的范圍，同時(shí)要注意離子強(qiáng)度應(yīng)低，可用透析、凝膠過(guò)濾或稀釋法達(dá)此目的。為了避免顆粒大小不等的交換劑在自然沉降時(shí)分層，要適當(dāng)加壓裝柱，同時(shí)使柱床壓緊，減少死體積，有利于分辨率的提高。洗滌好的纖維素使用前必須平衡至所需的pH和離子強(qiáng)度。溶脹的交換劑使用前要用稀酸或稀堿處理，使之成為帶H+或OH的交換劑型?！ 。ǘ╇x子交換層析法 離子交換層析法是以具有離子交換性能的物質(zhì)作固定相，利用它與流動(dòng)相中的離子能進(jìn)行可逆的交換性質(zhì)來(lái)分離離子型化合物的一種方法。測(cè)定未知物質(zhì)的分子量時(shí)，可將此樣品加在測(cè)定了標(biāo)準(zhǔn)曲線的凝膠柱內(nèi)洗腫后，根據(jù)物質(zhì)的洗脫體積，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出它的分子量。凝膠對(duì)熱原有較強(qiáng)的吸附力，可用來(lái)去除無(wú)離子水中的致熱原制備注射用水。柱長(zhǎng)與直徑之比為515，樣品體積可達(dá)柱床體積的25％30％，為了防止蛋白質(zhì)脫鹽后溶解度降低會(huì)形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸銨等揮發(fā)性鹽類緩沖液使層析柱平衡，然后加入樣品，再用同樣緩沖液洗脫，收集的洗脫液用冷凍干燥法除去揮發(fā)性鹽類。本法脫鹽操作簡(jiǎn)便、快速、蛋白質(zhì)和酶類等在脫鹽過(guò)程中不易變性。濕態(tài)保存方法是凝膠漿中加入抑菌劑或水沖洗到中性，密封后高壓滅菌保存。為了防止凝膠染菌，％的疊氮鈉，在下次層析前應(yīng)將抑菌劑除去，以免干擾洗脫液的測(cè)定。樣品加入后打開(kāi)流出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，當(dāng)樣品液面恰與凝膠床表面相平時(shí)，再加入數(shù)毫升洗脫液中洗管壁，使其全部進(jìn)入凝膠床后，將層析床與洗脫液貯瓶及收集器相連，預(yù)先設(shè)計(jì)好流速，然后分部收集洗脫液，并對(duì)每一餾份做定性、定量測(cè)定。一般樣品體積不大于凝膠總床體積的5％10％。平衡凝膠床過(guò)夜，使用前要檢查層析床是否均勻，有無(wú)“紋路”或氣泡，或加一些有色物質(zhì)來(lái)觀察色帶的移動(dòng)，如帶狹窄、均勻平整說(shuō)明層析柱的性能良好，色帶出現(xiàn)歪曲、散亂、變寬時(shí)必須重新裝柱。稍放置一段時(shí)間，再開(kāi)始流動(dòng)平衡，流速應(yīng)低于層析時(shí)所需的流速。加熱法既可節(jié)省時(shí)間又可消毒。 ?、衬z柱的制備凝膠型號(hào)選定后，將干膠顆粒懸浮于510倍量的蒸餾水或洗脫液中充分溶脹，溶脹之后將極細(xì)的小顆粒傾瀉出去。 ?、仓闹睆脚c長(zhǎng)度根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，組別分離時(shí)，大多采用230cm長(zhǎng)的層析柱，分級(jí)分離時(shí)，一般需要100cm左右長(zhǎng)的層析柱，其直徑在15cm范圍內(nèi)，小于1cm產(chǎn)生管壁效應(yīng)，大于5cm則稀釋現(xiàn)象嚴(yán)重。如果實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菍悠分幸恍┓肿恿勘容^近似的物質(zhì)進(jìn)行分離，這種分離又叫分級(jí)分離?！ 、蹦z的選擇根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌x擇不同型號(hào)的凝膠。它的突出優(yōu)點(diǎn)是層析所用的凝膠屬于惰性載體，不帶電荷，吸附力弱，操作條件比較溫和，可在相當(dāng)廣的溫度范圍下進(jìn)行，不需要有機(jī)溶劑
畢業(yè)設(shè)計(jì)相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1