層析技術(shù)的應(yīng)用(編輯修改稿)
2025-08-09 22:36 本頁面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 這時(shí)水分和低分子量的物質(zhì)就會(huì)進(jìn)入凝膠粒子內(nèi)部的孔隙中，而高分子物質(zhì)則排阻在凝膠顆粒之外，再經(jīng)離心或過濾，將溶脹的凝膠分離出去，就得到了濃縮的高分子溶液?！ 。ǘ╇x子交換層析法 離子交換層析法是以具有離子交換性能的物質(zhì)作固定相，利用它與流動(dòng)相中的離子能進(jìn)行可逆的交換性質(zhì)來分離離子型化合物的一種方法?！ 、彪x子交換劑預(yù)處理和裝柱對(duì)于離子交換纖維素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的顆粒，以保證有較好的均勻度，對(duì)于已溶脹好的產(chǎn)品則不必經(jīng)這一步驟。溶脹的交換劑使用前要用稀酸或稀堿處理，使之成為帶H+或OH的交換劑型。陰離子交換劑常用“堿酸堿”處理，使最終轉(zhuǎn)為OH型或鹽型交換劑；對(duì)于陽離子交換劑則用“酸堿酸”處理，使最終轉(zhuǎn)為H型交換劑。洗滌好的纖維素使用前必須平衡至所需的pH和離子強(qiáng)度。已平衡的交換劑在裝柱前還要減壓除氣泡。為了避免顆粒大小不等的交換劑在自然沉降時(shí)分層，要適當(dāng)加壓裝柱，同時(shí)使柱床壓緊，減少死體積，有利于分辨率的提高。柱子裝好后再用起始緩沖液淋洗，直至達(dá)到充分平衡方可使用?！ 、布訕优c洗脫加樣：層析所用的樣品應(yīng)與起始緩沖液有相同的pH和離子強(qiáng)度，所選定的pH值應(yīng)落在交換劑與被結(jié)合物有相反電荷的范圍，同時(shí)要注意離子強(qiáng)度應(yīng)低，可用透析、凝膠過濾或稀釋法達(dá)此目的。樣品中的不溶物應(yīng)在透析后或凝膠過濾前，以離心法除去。為了達(dá)到滿意的分離效果，上樣量要適當(dāng)，不要超過柱的負(fù)荷能力。柱的負(fù)荷能力可用交換容量來推算，通常上樣量為交換劑交換總量的1％5％?！ ∠疵摚阂呀Y(jié)合樣品的離子交換前，可通過改變?nèi)芤旱膒H或改變離子強(qiáng)度的方法將結(jié)合物洗脫，也可同時(shí)改變pH與離子強(qiáng)度。為了使復(fù)雜的組份分離完全，往往需要逐步改變pH或離子強(qiáng)度，其中最簡(jiǎn)單的方法是階段洗脫法，即分次將不同pH與離子強(qiáng)度的溶液加入，使不同成分逐步洗脫。由于這種洗脫pH與離子強(qiáng)度的變化大，使許多洗脫體積相近的成分同時(shí)洗脫，純度較差，不適宜精細(xì)的分離。最好的洗脫方法是連續(xù)梯度洗脫，洗脫裝置見圖166。兩個(gè)容器放于同一水平上，第一個(gè)容器盛有一定pH的緩沖液，第二個(gè)容器含有高鹽濃度或不同pH的緩沖液，兩容器連通，第一個(gè)容器與柱相連，當(dāng)溶液由第一容器流入柱時(shí)，第二容器中的溶液就會(huì)自動(dòng)來補(bǔ)充，經(jīng)攪拌與第一容器的溶液相混合，這樣流入柱中的緩沖液的洗脫能力即成梯度變化。第一容器中任何時(shí)間的濃度都可用下式進(jìn)行計(jì)算： C＝C2－（C2－C1）（1－V）A2/A1 式中AA2分別代表兩容器的截面積：CC2分別表示容器中溶液的濃度；V為流出體積對(duì)總體積之比。當(dāng)A1＝A2時(shí)為線性梯度，當(dāng)A1＞A2時(shí)為凹形梯度，A1＞A2時(shí)為凸形梯度?！ ∠疵摃r(shí)應(yīng)滿足以下要求：①洗脫液體積應(yīng)足夠大，一般要幾十倍于床體積，從而使分離的各峰不致于太擁擠。②梯度的上限要足夠高，使緊密吸附的物質(zhì)能被洗脫下來。③梯度不要上升太快，要恰好使移動(dòng)的區(qū)帶在快到柱末端時(shí)達(dá)到解吸狀態(tài)。目的物的過早解吸，會(huì)引起區(qū)帶擴(kuò)散；而目的物的過晚解吸會(huì)使峰形過寬。圖166 梯度洗脫示意圖 ?、诚疵擆s份的分析 按一定體積（510ml/管）收集的洗脫液可逐管進(jìn)行測(cè)定，得到層析圖譜。依實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡牟煌?，可采用適宜的檢測(cè)方法（生物活性測(cè)定、免疫學(xué)測(cè)定等）確定圖譜中目的物的位置，并回收目的物?！ 、措x子交換劑的再生與保存離子交換劑可在柱上再生。如離子交換纖維素可用2mol/:NaCl淋洗柱，；若有脂溶性物質(zhì)則可用非離子型去污劑洗柱后再生，也可用乙醇洗滌，其順序?yàn)椋海aOH水。保存離子交換劑時(shí)要加防腐劑。％氯已定（洗必泰），陽離子交換劑可用乙基硫柳汞（％）。％疊氮鈉?！ 、惦x子交換層析的應(yīng)用離子交換層析技術(shù)已廣泛用于各學(xué)科領(lǐng)域。在生物化學(xué)及
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