層析技術(shù)的應用(編輯修改稿)
2024-08-09 22:36 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 這時水分和低分子量的物質(zhì)就會進入凝膠粒子內(nèi)部的孔隙中，而高分子物質(zhì)則排阻在凝膠顆粒之外，再經(jīng)離心或過濾，將溶脹的凝膠分離出去，就得到了濃縮的高分子溶液?！ 。ǘ╇x子交換層析法 離子交換層析法是以具有離子交換性能的物質(zhì)作固定相，利用它與流動相中的離子能進行可逆的交換性質(zhì)來分離離子型化合物的一種方法?！ 、彪x子交換劑預處理和裝柱對于離子交換纖維素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的顆粒，以保證有較好的均勻度，對于已溶脹好的產(chǎn)品則不必經(jīng)這一步驟。溶脹的交換劑使用前要用稀酸或稀堿處理，使之成為帶H+或OH的交換劑型。陰離子交換劑常用“堿酸堿”處理，使最終轉(zhuǎn)為OH型或鹽型交換劑；對于陽離子交換劑則用“酸堿酸”處理，使最終轉(zhuǎn)為H型交換劑。洗滌好的纖維素使用前必須平衡至所需的pH和離子強度。已平衡的交換劑在裝柱前還要減壓除氣泡。為了避免顆粒大小不等的交換劑在自然沉降時分層，要適當加壓裝柱，同時使柱床壓緊，減少死體積，有利于分辨率的提高。柱子裝好后再用起始緩沖液淋洗，直至達到充分平衡方可使用。 ?、布訕优c洗脫加樣：層析所用的樣品應與起始緩沖液有相同的pH和離子強度，所選定的pH值應落在交換劑與被結(jié)合物有相反電荷的范圍，同時要注意離子強度應低，可用透析、凝膠過濾或稀釋法達此目的。樣品中的不溶物應在透析后或凝膠過濾前，以離心法除去。為了達到滿意的分離效果，上樣量要適當，不要超過柱的負荷能力。柱的負荷能力可用交換容量來推算，通常上樣量為交換劑交換總量的1％5％?！ ∠疵摚阂呀Y(jié)合樣品的離子交換前，可通過改變?nèi)芤旱膒H或改變離子強度的方法將結(jié)合物洗脫，也可同時改變pH與離子強度。為了使復雜的組份分離完全，往往需要逐步改變pH或離子強度，其中最簡單的方法是階段洗脫法，即分次將不同pH與離子強度的溶液加入，使不同成分逐步洗脫。由于這種洗脫pH與離子強度的變化大，使許多洗脫體積相近的成分同時洗脫，純度較差，不適宜精細的分離。最好的洗脫方法是連續(xù)梯度洗脫，洗脫裝置見圖166。兩個容器放于同一水平上，第一個容器盛有一定pH的緩沖液，第二個容器含有高鹽濃度或不同pH的緩沖液，兩容器連通，第一個容器與柱相連，當溶液由第一容器流入柱時，第二容器中的溶液就會自動來補充，經(jīng)攪拌與第一容器的溶液相混合，這樣流入柱中的緩沖液的洗脫能力即成梯度變化。第一容器中任何時間的濃度都可用下式進行計算： C＝C2－（C2－C1）（1－V）A2/A1 式中AA2分別代表兩容器的截面積：CC2分別表示容器中溶液的濃度；V為流出體積對總體積之比。當A1＝A2時為線性梯度，當A1＞A2時為凹形梯度，A1＞A2時為凸形梯度?！ ∠疵摃r應滿足以下要求：①洗脫液體積應足夠大，一般要幾十倍于床體積，從而使分離的各峰不致于太擁擠。②梯度的上限要足夠高，使緊密吸附的物質(zhì)能被洗脫下來。③梯度不要上升太快，要恰好使移動的區(qū)帶在快到柱末端時達到解吸狀態(tài)。目的物的過早解吸，會引起區(qū)帶擴散；而目的物的過晚解吸會使峰形過寬。圖166 梯度洗脫示意圖 ?、诚疵擆s份的分析 按一定體積（510ml/管）收集的洗脫液可逐管進行測定，得到層析圖譜。依實驗目的的不同，可采用適宜的檢測方法（生物活性測定、免疫學測定等）確定圖譜中目的物的位置，并回收目的物?！ 、措x子交換劑的再生與保存離子交換劑可在柱上再生。如離子交換纖維素可用2mol/:NaCl淋洗柱，；若有脂溶性物質(zhì)則可用非離子型去污劑洗柱后再生，也可用乙醇洗滌，其順序為：％NaOH水。保存離子交換劑時要加防腐劑。％氯已定（洗必泰），陽離子交換劑可用乙基硫柳汞（％）。％疊氮鈉。 ?、惦x子交換層析的應用離子交換層析技術(shù)已廣泛用于各學科領(lǐng)域。在生物化學及
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