層析和膜技術(shù)在生物制藥中的應用(2)-文庫吧資料
2025-01-19 22:17本頁面
【正文】 將蛋白質(zhì)置換下來，這些方式的機理都是通過降低固定化金屬離子和蛋白質(zhì)之間的親和常數(shù)。 金屬螯合親和層析柱的制備： 將環(huán)氧活化型 Sepharose 6B與金屬螯合劑（如亞氨二醋酸）偶聯(lián)成配基，再用金屬離子溶液處理（如Zn2+、 Cu2+、 Co2+、 Ni2+、 Cd2+），即成。蛋白質(zhì)表面的氨基酸殘基，如組氨酸的咪唑基團、半胱氨酸的巰基、色氨酸的吲哚基團，可提供電子，與金屬離子結(jié)合，從而發(fā)生親和層析。 ? 例如分離胰島素受體時，把胰島素作為配基，偶聯(lián)于瓊脂載體上，經(jīng)親和層析，從肝臟勻漿中提取胰島素受體，純化達 8000倍。 親和層析的設(shè)計原理和過程 : ?由于親和層析技術(shù)具有簡便，快速、專一和高效等特點，應用十分廣泛，已普及到生命科學的各個領(lǐng)域。 凝膠層析的應用 :分子量測定 三 . 親和層析 ? 人們發(fā)現(xiàn)生物體中許多高分子化合物具有和某些相對應的專一分子可逆結(jié)合的特性， ? 例如 酶與底物、抗原與抗體、激素與受體、核糖核酸與其互補的脫氧核糖核酸，多糖與蛋白復合體等，都具有這種特性。 10%。 ?先以 3個以上的已知分子量的標準蛋白（有標準蛋白商品出售）過柱，測取各目 Ve值，以 Ve做縱坐標， logM 做橫坐標制作標準曲線，之后在同一測定系統(tǒng)測取未知物質(zhì)的 Ve值，即可由標準曲線求得分子量。 ?待測物質(zhì)洗脫體積與分子量關(guān)系符合下式： Ve=KlogM+C K、 C 是常數(shù)，為直線方程的斜率和外推截距。 凝膠層析的應用 :分離純化 用 SephadexG50純化牛、豬胰島素 : 用 SephadexG25分離氨基酸混合物 用 SephadexG25分離氨基酸混合物 ? 用葡聚糖凝膠分離多組分混合物，除利用分子篩效應外，還可利用某些物質(zhì)與凝膠具有程度不等的弱吸附作用。 凝膠層析的應用 :脫鹽和濃縮 方法： ?柱層析 ?包埋法 樣品置于透析袋中埋入干膠顆粒堆內(nèi)，經(jīng)過相當時間后，樣品中的鹽與水分一道為干膠所吸收。 ? 洗脫多為易揮發(fā)鹽的緩沖溶液； ∵ 用水洗脫時，有些蛋白質(zhì)脫鹽后溶解度下降，造成被凝膠粒吸附甚至以沉淀狀態(tài)析出。 ? 脫鹽用的凝膠多用大粒度的、高交聯(lián)度的凝膠。 ?如果樣品中含有 3個組分的話，最好一個接近全排阻，另一個接近全滲入，第三個為部分滲入，且分子量大于滲入限的 3倍，并小于排阻限的 1/3。 凝膠層析的應用 ?分級分離，將分子量相差不很大的大分子物質(zhì)加以分離，如分離血清球蛋白與白蛋白。 凝膠層析的應用 ?凝膠層析目的（或稱分離形式）一般有二種：分組分離和分級分離。 凝膠層析分離原理 凝膠層析的總床體積（ V t ），可分為三個組分，即 hdVVVVgiot24????? V o ：凝膠顆粒之間的液相體積，稱外水體積； V i ：凝膠顆粒內(nèi)部所含的液相體積，稱內(nèi)水體積； V g ：凝膠顆粒本身的體積； d ：層析柱直徑； h ：凝膠柱床之高。 凝膠層析分離原理 分子篩理論最容易理解 ， 當含有大小分子
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