【正文】 胞工程。5植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)：在人工控制下高密度大朗養(yǎng)有益植物細(xì)胞即植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)。99．C—CSF和GM—CSF的異同點(diǎn)：由于G—CSF和GM—CSF在許多相關(guān)的臨床病例中可能有用，所以它們之間生物學(xué)特性差異，對(duì)某些疾病發(fā)病機(jī)理的認(rèn)識(shí)有一定的意義；(1)C—CSF特異性刺激中性白細(xì)胞，而GM—CSF則是所有粒細(xì)胞的總刺激因子，例如若要通過(guò)提高嗜酸性效應(yīng)細(xì)胞水平來(lái)治療寄生蟲(chóng)感染，則GM—CSF作用比G—CSF為好；(2)GM—CSF是單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的強(qiáng)激活劑，則G—CSF則不是，這種激活包括誘導(dǎo)產(chǎn)生諸如腫瘤壞死因子和IL—1類(lèi)的其他自考現(xiàn)代生物制藥技術(shù)細(xì)胞因子，如需提高單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞活性，可選用CM—CSF，而不是C—CSF； 的主要部位，也是參與炎癥的主要組織，內(nèi)皮細(xì)胞本身也是產(chǎn)生細(xì)胞因子的重要（另附：工藝流程圖）(3)CM—CSF是中性白細(xì)胞移動(dòng)的強(qiáng)抑制劑，然而G—CSF則增強(qiáng)中性白細(xì)胞的移 動(dòng)，例如當(dāng)局部損傷時(shí)，GM—CSF可在局部產(chǎn)生，起弱的化學(xué)引誘劑作用，抑制炎癥細(xì)胞離開(kāi)炎癥部位，而G—CSF則可增強(qiáng)炎癥狀細(xì)胞向炎癥部位移動(dòng)，這可能是兩種造血生長(zhǎng)因子共同提高宿主防御力的一種途徑，在細(xì)菌性膿毒癥時(shí)，接觸內(nèi)毒素可刺激單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞產(chǎn)生G—CSF，然后G—CSF刺激T細(xì)胞產(chǎn)生GM—CSF和IL—3，以增加骨髓內(nèi)的骨髓細(xì)胞生成和進(jìn)一步增強(qiáng)白細(xì)胞應(yīng)答。集落形成細(xì)胞的分裂需要CSF持續(xù)存在，如從培養(yǎng)基中撤掉CSF，則細(xì)胞分裂停止，CSF的濃度決定細(xì)胞周期長(zhǎng)短和產(chǎn)生子代細(xì)胞的總數(shù)目；(2)CSF既維系祖細(xì)胞的存活，也延長(zhǎng)成熟細(xì)胞的壽命；(3)分化定型；(4)刺激終末細(xì)胞的功能活性。98．集落刺激因子的功能：各種CSF的活性是以半固體培養(yǎng)基中CSF刺激造血細(xì)胞形成集落的能力來(lái)衡量的。的方法。(4)殘余DNA檢測(cè)：采用同94．細(xì)胞因子的分子生物學(xué)位素探針?lè)ǎ縿堄郉NA測(cè)定法：量不得超過(guò)100pg；目前采用的分子生物學(xué)技 還有生物制品要求的常規(guī)術(shù)有RNA印跡法、核酸酶保實(shí)驗(yàn)檢定，如熱原質(zhì)測(cè)定、護(hù)分析、原位雜交和多聚酶制劑水分測(cè)定、安全試驗(yàn)、鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞因子激活96．人淋巴細(xì)胞幾—2的制的殺傷細(xì)胞活性。90．紅細(xì)胞生成素的測(cè)定方法：（1）生物體內(nèi)測(cè)定法；（2）生物體外測(cè)定法；（3）放射免疫測(cè)定法。86．干擾素的生物功能本質(zhì)：（1）抗細(xì)胞內(nèi)侵害；①抑制病毒繁殖；②抑制胞內(nèi)的其它微生物繁殖；（2）抗細(xì)胞分裂活性；（3）調(diào)節(jié)免疫功能活性；①調(diào)節(jié)免疫監(jiān)視功能；②調(diào)節(jié)免疫自穩(wěn)功能； 87．基因工程干擾素的制備方法：（1）干擾素工程菌的組建；①分離提取干擾素基因；②制備人工重組質(zhì)粒；③轉(zhuǎn)化宿主菌；（2）基因工程干擾素的制備；（3）基因工程干擾素的質(zhì)量控制； 88．集落刺激因子的檢測(cè)方法：（1）生物活性檢測(cè)法；①骨髓細(xì)胞集落形成法；②依賴細(xì)胞株；（2）分子生物學(xué)檢測(cè)法；斑點(diǎn)雜交法；（3）免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)；雙抗體夾心ELISA法。84．細(xì)胞因子的受體，根據(jù)其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和功能分類(lèi)：抗細(xì)菌、抗真菌作用；（8）熱原質(zhì)作用；（9）參與骨質(zhì)重吸收。82．TNF抗腫瘤作用的可能機(jī)制：（1）細(xì)胞的直接細(xì)胞毒及細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用；（2）腫瘤內(nèi)血管陰塞引起腫瘤缺血性壞死；（3）TNF的免疫調(diào)節(jié)作用可能在其抗瘤效應(yīng)中起一定的作用。80．集落刺激因子的功能：（1）刺激造血細(xì)胞增殖；（2）維持細(xì)胞存活；（3）分化定型；（4）刺激終末細(xì)胞的功能活性。78．真核基因在原核細(xì)胞中獲得表達(dá)必須具備的三個(gè)條件：（1）要有原核細(xì)胞的啟動(dòng)子；（2）要有能與原核細(xì)胞16SrRNA3’端相配合的順序；（3）表達(dá)的干擾素多肽要不被細(xì)胞酶類(lèi)所迅速降解。76．用于制備細(xì)胞因子的培養(yǎng)細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)十分嚴(yán)格，對(duì)這些細(xì)胞的要求包括：（1）細(xì)胞來(lái)源要清楚；（2）細(xì)胞建株的鑒定資料要記錄清楚；（3）了解細(xì)胞系的生長(zhǎng)特性和在培養(yǎng)條件下的細(xì)胞的穩(wěn)定性；（4）培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)所用的血清不含細(xì)菌、病菌、真菌和支原體。74．集落刺激因子的臨床應(yīng)用：（1）治療血細(xì)胞減少癥；（2）治療再生障礙性貧血、骨髓發(fā)育不良和自體骨髓移植后的恢復(fù)；（3）治療癌癥；（4）治療AIDS。：(1)攪拌罐型反應(yīng)器；(2)固定床型反應(yīng)器；(3)流化床型反應(yīng)器；(4)膜型反應(yīng)器；(5)鼓泡塔型反應(yīng)器； 59．固定化酶的形狀：（1）顆粒狀固定化酶；（2）纖維應(yīng)液，置于沸水中，加熱使酶失知；（2）立即加入適宜的酶變性劑，使酶變性失活；3）加入酸或堿溶液，使反應(yīng)液的pH值迅速遠(yuǎn)離酶催化應(yīng)的最適pH值；（4）將取出的反應(yīng)液立即置于冰，或冰鹽溶液中，使反應(yīng)0液的溫度迅速低至10C以下。50．中空纖維培養(yǎng)器優(yōu)點(diǎn)：（1）細(xì)胞生長(zhǎng)密度高；（2）營(yíng)養(yǎng)牧質(zhì)可有效分布，代謝產(chǎn)物可及時(shí)排除；（3）細(xì)胞培養(yǎng)可達(dá)數(shù)日，易于實(shí)現(xiàn)連續(xù)培養(yǎng)；（4）細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)濃度高；（5）反應(yīng)器體積小并可用于培養(yǎng)多種細(xì)胞。48．深凍植物細(xì)胞復(fù)蘇后測(cè)其生命活力與存活率的三種方法：（1）再培養(yǎng)法：將復(fù)蘇后細(xì)胞立即接種于新鮮培養(yǎng) 基上再培養(yǎng)，同時(shí)測(cè)定細(xì)胞增殖量，愈傷組織形成情況及人化為新植株能力；（2）二醋酸光素染色法：%熒光素染料溶液與一滴化凍后細(xì)胞懸浮液混合，活細(xì)胞染色，死細(xì)胞不著色，用普通顯微鏡觀察計(jì)數(shù)得細(xì)胞總數(shù)，用紫外光顯微鏡觀計(jì)數(shù)得活細(xì)胞數(shù)，據(jù)此可計(jì)算出凍存細(xì)胞存活率；（3）TTC法：根據(jù)活細(xì)胞內(nèi)脫氫酶可將氯化三苯四氮唑還原為for mazam,后者溶于乙醇而不溶于水，故前者與凍細(xì)胞保溫反應(yīng)用乙醇抽提，再用分光光度法測(cè)定吸收度，用以判斷細(xì)胞存活率及生活力。再制備3個(gè)／ml細(xì)胞懸液，加入另外兩塊96孔板中，將上述各板置37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)23周，待出現(xiàn)可見(jiàn)細(xì)胞集落后，檢查培養(yǎng)液中抗體活性，選出陽(yáng)性孔，擴(kuò)大培養(yǎng)，如上法進(jìn)行反復(fù)克隆，直至選出純雜交瘤細(xì)胞為止。（2）PEG誘導(dǎo)融合；（3）45．微載體培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)：兼電場(chǎng)誘導(dǎo)融合；（4）聚乙烯有固定培養(yǎng)與懸浮培養(yǎng)雙醇分離心力也能促進(jìn)融合。組型正常；（2）培養(yǎng)條件下44．無(wú)血清培養(yǎng)基分類(lèi)：（1）呈有限生命力，不能無(wú)限期基本合成培養(yǎng)基；（2）基本分裂繁殖；（3）無(wú)致癌性。養(yǎng)。子水平上解析出存在于病34．篩選植物雜種細(xì)胞的方毒表面的抗原或受體；（5）法；1）遺傳互補(bǔ)篩選法；可用不純抗原制備純（2）抗性互補(bǔ)篩選法；（3）MCAb；（6）但MCAb專一性利用物理特性篩選法；4）太強(qiáng)，難于檢出微生物突變利用生長(zhǎng)特性篩選法。33．植物細(xì)胞融合的特點(diǎn)：（3）消失作用指親本細(xì)胞（1）可以實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣雜交，某些遺傳性狀在雜種細(xì)胞獲得種間雜種，克服有性雜中消失的現(xiàn)象；（4）激活與交配系不親和性；（2）可獲消失作用指在雜種細(xì)胞中得另一親本非整倍性雜種原親本非活動(dòng)基因被激活，或胞質(zhì)雜種，且獲得的遺傳而同一親本某些遣傳性狀變異范圍極廣；（3）一次操同時(shí)消失的現(xiàn)象?；パa(bǔ)選擇法；（4）原位雜交32．植物細(xì)胞分化培養(yǎng)基與法；（5）基因探針選擇法。合，即或獲得相應(yīng)雜種細(xì)31．測(cè)定植物原生質(zhì)體活力胞。28．種質(zhì)保存意義：（1）植物組織及細(xì)胞移植繼代培養(yǎng)過(guò)程可能導(dǎo)師致染色體30．植物細(xì)胞生長(zhǎng)所需的營(yíng)過(guò)程：動(dòng)物細(xì)胞破碎后，經(jīng)養(yǎng)成份：H2O、無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)物、差分分離出線粒體及溶酶維生素、碳源、天然物、植體等細(xì)胞器，或采用生化技物激素、氨基酸類(lèi)、核酸及術(shù)分離出的DNA，mRNA，逆其水解物以及其它成分。25．微生物工程產(chǎn)品主要類(lèi)型：（1）微生物菌體；（2）初級(jí)代謝物；（3）次級(jí)代謝物；（4）生物活性大分子； 26．微生物工程在醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用：（1）抗生素類(lèi)；（2）氨基酸類(lèi)；（3）核苷酸類(lèi)；（4）維生素類(lèi)；（5）甾體類(lèi)激素；（6）治療酶及酶抑制劑。23．工業(yè)發(fā)酵中提高發(fā)酵液的溶氧水平的措施：（1）提高通氣強(qiáng)度；（2）增加攪拌轉(zhuǎn)速；（3）增加罐壓；（4）增加擋板；（5）通氣中摻入純氧；（6）控制基質(zhì)培養(yǎng)基；（7）控制補(bǔ)料率；（8）調(diào)節(jié)溫度；（9）添加表面活性劑；（10）中間補(bǔ)水；11）液化培養(yǎng)基。1ml2細(xì)胞懸液，于37℃CO培養(yǎng)箱中溫育，然后從陰性孔中吸取細(xì)胞計(jì)數(shù)，用完全培養(yǎng)基稀釋成30個(gè)／ml加入96孔板中，余下細(xì)胞再稀釋成10／ml，再加于兩塊96孔板中，每孔（1）斜面低溫保藏法；（2）液體石蠟封存法；（3）沙土管保存法；（4）冷凍干燥保存法；（5）超低溫保藏法。39．脂質(zhì)體介導(dǎo)的細(xì)胞融合量與常規(guī)單層培養(yǎng)相同，通過(guò)增加培養(yǎng)罐體積即可達(dá)到擴(kuò)大培養(yǎng)規(guī)模的目的，減少?gòu)S房及設(shè)備投資，節(jié)約動(dòng)力消耗及人力，又便于對(duì)反應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)控制。21．微生物菌種保存方法：及基因型變異；2）森林及土地?zé)o止盡開(kāi)發(fā)利用，自然種質(zhì)庫(kù)破壞，需建產(chǎn)人工種質(zhì)庫(kù)；（3）細(xì)胞工程中獲得的中草藥及農(nóng)作物優(yōu)良品種的特殊變異細(xì)胞及雜種細(xì)胞，常規(guī)保存法易于變異，需進(jìn)行種質(zhì)資源廣泛收集與長(zhǎng)期保存；（4）細(xì)胞培養(yǎng)建立的人工種質(zhì)庫(kù)可節(jié)省土地與勞務(wù)。19．單孢子懸液的制備方法：（1）對(duì)于細(xì)菌，因其在固體斜面培養(yǎng)基上常粘在一起，故要求轉(zhuǎn)接到新鮮肉自考現(xiàn)代生物制藥技術(shù)湯液體中進(jìn)行培養(yǎng)，以取笪分散且生長(zhǎng)活躍的菌體；（2）對(duì)放線菌和霉菌的孢子，采用玻璃珠或石英砂振蕩打散孢子后，用濾紙或棉花過(guò)濾。16．培養(yǎng)基的配制原則：1）營(yíng)養(yǎng)成分配制原則：2）營(yíng)養(yǎng)成分配比應(yīng)恰當(dāng)；（3）滲透壓應(yīng)合適；（34）pH值應(yīng)合適；（5）氧化還原電位需符合要求。15．配制工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基的一般要求：（1）營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的組成比較豐富，濃度恰當(dāng)，能滿蹉力種發(fā)芽和生長(zhǎng)繁殖成大量的有生理功能的菌絲體之需要；（2）在一定條件下，所采用的原料彼此之間不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，理化性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定；（3）粘度適中，最有適當(dāng)?shù)臐B透壓；（4）要考慮所采用的原材料的品種和濃度，與代謝產(chǎn)物生物合成過(guò)程中的調(diào)節(jié)關(guān)系；（5）生產(chǎn)過(guò)程中，既不影響通氣與攪拌的效果，又不影響產(chǎn)物的分離，精制，以及廢物的處理。（1）具有λ噬菌體的特性，14．堿裂解法制備質(zhì)粒DNA能高效地轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，但的方法：它不含λ噬菌體的全部必（1）接種菌落于含抗生素要基因，不能裂解生成噬菌的LB中，370C劇烈振蕩反斑；（2）具有質(zhì)粒載體的特應(yīng)；（2）培養(yǎng)液性，帶有質(zhì)粒的抗性基因而40C12000rpm30min離心；易于篩選。（1）λ噬菌體可在體外包13．基因表達(dá)的三個(gè)基本條裝成病毒顆粒，高效地轉(zhuǎn)染件：大腸桿菌；（2）λDNA的長(zhǎng)（1）基因的密碼區(qū)不能被度只有在野生λ噬菌體的插入序列所中斷；（2）基因75%105%之間才能夠包裝；必須在啟動(dòng)子控制之下；（3）λ噬菌體適于克隆大（3）mRNA必須相當(dāng)穩(wěn)定并片段DNA及組建基因文庫(kù)。則：12．DNA分子轉(zhuǎn)化機(jī)理：（1）大質(zhì)粒（大于15Kb）（1）吸附：完整的雙鏈DNA易受損，故應(yīng)采用溫和裂解分子吸附在受體菌的表面；法（SDS裂解法）從細(xì)胞中（2）轉(zhuǎn)入：雙鏈DNA分子釋放出來(lái)；解鏈，單鏈DNA進(jìn)入受體（2）對(duì)于小質(zhì)粒，可加入菌，另一鏈降解；（3）自穩(wěn)：EDTA后采用溶菌酶處理，外源質(zhì)粒DNA分子在細(xì)胞再通過(guò)煮沸或堿處理使之內(nèi)又復(fù)制成雙鏈環(huán)狀DNA裂解。（3）M13噬菌體；（4）科11．受體細(xì)胞一般具有的性斯質(zhì)粒；（5）動(dòng)、植物病毒。體的重組；（4）重組克隆的10．DNA連接反應(yīng)中的注意轉(zhuǎn)化與感染；（5）重組克隆事項(xiàng)： 的篩選與鑒定；（6）目的基（1）連接及反應(yīng)溫度；（2）因的表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的分防止粘末端的自身環(huán)化應(yīng)離與提純；采取以下措施：①控制載體2．載體的基本條件： 與外源DNA分子的濃度與（1）本身是一個(gè)復(fù)制子，比例；②用堿性磷酸酶處理能自我復(fù)制；（2）分子量要載體防止自身環(huán)化；③定向小；（3）帶選擇標(biāo)記，以便克??；（3）用λDNA和科斯進(jìn)入宿主細(xì)胞后有可辨認(rèn)質(zhì)粒的載體時(shí)的連接；①λ的表型特征；（4）對(duì)幾種限D(zhuǎn)NA載體應(yīng)考慮兩個(gè)參數(shù)：制性酶有單一切點(diǎn)：（5）有插入分子左右臂的比例，兩一定的非必要區(qū)，在這段插者的濃度；②科斯質(zhì)粒常用入外源基因不影響其復(fù)制。（2）酶AMP復(fù)合物再結(jié)合三、重點(diǎn)問(wèn)題 到具有5，一磷酸基與3，羥1．重組DNA技術(shù)通常包括： 基切口的DNA上，使DNA（1）基因重組載體的選擇腺苷化。82．體外實(shí)CSF可引起腫瘤細(xì)胞增殖。80．IFN可以抑制正常細(xì)胞的生長(zhǎng)。78．TNF直接注入是很有效的。76．去除糖鏈后IL10的抗原性不受影響。74．ILlα與IL1β可識(shí)別相同的受體。72．細(xì)胞因子大都是糖蛋白類(lèi)物質(zhì)。70．關(guān)于集落刺激因子的特性，目前認(rèn)為四種集落刺激因子無(wú)序列同源性，均為糖蛋白分子，四種集落刺激因子各有特征的膜受體。68．T細(xì)胞的激活與增殖包括三個(gè)時(shí)期，即細(xì)胞產(chǎn)生白介素2及其受體表達(dá)，細(xì)胞進(jìn)入不依賴白介2的增殖期。66．干擾素制劑的局部用藥多采用噴霧、貼敷、滴鼻。12000rpm離心5min，轉(zhuǎn)移上清；（7）上清加等量酚；0氯仿抽提，4C，12000rpm離心2min，收集上清；（8）64．人白細(xì)胞干擾素制劑的半成品檢定包括比活性測(cè)定、無(wú)菌試驗(yàn)、余毒試驗(yàn)、安全試驗(yàn)及硫氰酸鉀殘余量檢測(cè)。制，是以雙鏈DNA庫(kù)間媒介；利于體外純化；（2）不論單鏈DNA還是雙鏈復(fù)制形式DNA均能夠感染大腸桿菌；（3）單鏈DNA噬菌體顆粒的大小，是受其DNA多制約，而不存在包裝限制問(wèn)題；（4）可以容易地測(cè)定出外源DNA片段的插入取向。89．TNF分子量因來(lái)源不同，制備方法不同及測(cè)定方法不同相差較大。87．誘導(dǎo)TEF合成須經(jīng)過(guò)兩個(gè)階段：起動(dòng)期、促發(fā)期。84．細(xì)胞因子很難用常規(guī)方法純化。62．干擾素基因在正常生理狀態(tài)下不表達(dá)。60．干擾素可導(dǎo)致病毒繁殖中斷。58．天然干擾素是一種糖蛋白。56．可導(dǎo)致EPO生成增加的因素包括高原氣候、冠心病、肺心病、溶血性貧血等。54．IFN可抑制病素的生活周期的許多階段，包括病毒的吸附和脫殼、早期病毒轉(zhuǎn)錄、病毒轉(zhuǎn)譯、蛋白合成及從細(xì)胞表面芽生。52．IFN也可誘生IFN。50．IFN的蛋的產(chǎn)物包括IFNα，IFNβ及IFNy。48．IL5對(duì)細(xì)胞的作用包括增強(qiáng)B細(xì)胞的功能，促進(jìn)活性B細(xì)胞分泌，并可誘導(dǎo)B細(xì)胞表達(dá)IL2受體。46．細(xì)胞因子使用的最終效應(yīng)部位在細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)。44．TNF對(duì)蛋白酶最為敏感。41．CTL細(xì)胞對(duì)射線照射最為敏感。39．酵母屬于真核生物，大腸肝菌，放線菌及蘭細(xì)菌等屬于原核生物，但它們均為單細(xì)胞生物。37．干擾素的受體主要存在于細(xì)胞膜中。