生化分離技術(shù)第七章_層析技術(shù)-在線瀏覽
2025-03-01 15:34本頁面
【正文】 —— 流動相中的濃度。一般情況下 ， 溫度與平衡系數(shù)成反比 ， 各組分平衡系數(shù) K的差異程度決定了色譜分離的效果 ， K值差異越大 ， 色譜分離效果越理想 。 設(shè)體積為 V的流動相流過色譜系統(tǒng)，流速很慢，可以認為溶質(zhì)在兩相間平衡，則： msVVA K A?? ?溶 質(zhì) 移 動 距 離 能 進 行 分 配 的 有 效 截 面 積流動相移動距離 = V/Am mfmsARA KA? ? 由阻滯因數(shù)的定義式可得： 因此，當 Am、 As一定時（與裝柱時的緊密程度有關(guān)），一定的平衡系數(shù) K有相應(yīng)的 Rf值。色譜圖的縱坐標為檢測器的響應(yīng)信號；橫坐標為時間 t， 也可用流動相體積 V或距離 L表示。使基線發(fā)生細小波動的現(xiàn)象稱為噪音，如圖 73中的空氣峰。 圖 73 色譜圖 （ 2）色譜峰 當樣品中的組分隨流動相流入檢測器時，檢測器的響應(yīng)信號大小隨時間變化所形成的峰形曲線稱為色譜峰，峰的起點和終點的連接直線稱為峰底。但實際上，流出曲線并非完全對稱，不正常的色譜峰有拖尾峰和前伸峰，如圖 74(b)、 (c)所示。保留值可作為定性分析的參數(shù)，由于計量單位的不同，分別稱為保留時間、保留體積。 ②保留體積 VR 從開始進樣到柱出口處被測組分出現(xiàn)濃度最大值時所通過的流動相體積，稱為保留體積。 ④ 死體積 V0 不被固定相滯留的組分，從進樣到出現(xiàn)最大峰值所需流動相的體積，稱為死體積。 ⑤ 校正保留時間 tR′ 扣除死時間后的保留時間稱為校正保留時間（或調(diào)整保留時間），如圖 73所示；校正保留時間可理解為組分在固定相中實際滯留的時間。保留體積 VR中扣除死體積 V0后，即校正保留體積VR′ ， 將更合理地反映被測組分的保留特點。 ,其定義式為： （ 72） 式中 t′R t′R1 —— 分別為被測物質(zhì)和參比物質(zhì)的校正保留時間； V′R V′R2 —— 分別為被測物質(zhì)和參比物質(zhì)的校正保留體積。 222 ,111RRRRtVrtV?????? （ 5）峰高與峰面積 色譜峰頂點與峰底之間的垂直距離稱為峰高，用 h表示；峰與峰底之間的面積稱為峰面積，用 A表示，可作為定量分析的參數(shù)。色譜峰的區(qū)域?qū)挾韧ǔＳ腥N表示方法： ①標準偏差 σ 即 。它與標準偏差的關(guān)系為： W1/2 = 。它與標準偏差的關(guān)系為： W = 4σ。在理想的色譜中，組分的譜帶應(yīng)是很窄的，若譜帶較寬，將直接導(dǎo)致分離效果下降。 分離度 R綜合考慮了保留值的差值與峰寬兩方面的因素對柱效率的影響，可衡量色譜柱的總分離效能。當 R1時，兩峰有部分重疊；當 R = 1時，兩峰有 98%的分離；當 R = ，分離程度可達 %；一般用 R = 離的標志。這一小段色譜柱可看成是一個理論塔板，相當于精餾操作中的一塊理論塔板，一個理論塔板所對應(yīng)的色譜柱的長度稱為理論塔板高度（理論板高），一個色譜柱可包含若干個理論塔板。單位長度色譜柱內(nèi)包含的理論塔板數(shù)越多，流動相通過的塔板數(shù)也越多，說明流動相流過色譜柱的平衡次數(shù)越多，色譜柱的分離效率就越高。 二 、 層析分類 1． 流動相與固定相 層析法根據(jù)流動相的相態(tài)分氣相層析法、液相層析法和超臨界流體層析法。生物物質(zhì)一般存在于水溶液中，因此，生物分離主要采用液相層析法，如固定相為液體的分配層析法，如固定相為固體的吸附層析法及固定相為固定于固體表面的液體薄層（以固體為載體）的分配層析法等。 紙層析和薄層層析多用于分析目的 ， 而柱層析易于放大 ， 適用于大量制備分離 ， 是主要的層析分離手段 。 高壓液相層析法中層析介質(zhì) （ 固定相 ）微細 ， 分離精度高 、 速度快 ， 主要用于成分分析 。 第二節(jié) 凝膠過濾層析 一 、 原理與操作 1． 凝膠層析的原理 凝膠過濾層析 (Gel filtration chromatography， GFC)又稱體積排阻層析 、 分子篩層析 ， 是利用凝膠粒子 (通常稱為凝膠過濾介質(zhì) )為固定相 ， 根據(jù)料液中溶質(zhì)相對分子質(zhì)量的差別進行分離的液相層析法 。 相對分子質(zhì)量大于溶質(zhì) l和小于溶質(zhì) 4的溶質(zhì)的洗脫體積分別與溶質(zhì) 1和溶質(zhì) 4相同 。因此， GFC操作一般采用組成一定的洗脫液進行洗脫展開，這種洗脫法稱為恒定洗脫法 (isocratIc elution)?？梢詫⑺鼈兘菰谙疵搫┲?，慢慢攪拌。 （ 2） 裝柱 裝柱前 ， 柱的底部要先放些玻璃棉 、 玻璃細孔板等可拆卸的支持物 ， 以支持固定相 。 床層要均勻 ， 不能有紋路或氣泡 。 （ 3）上樣和洗脫 柱床經(jīng)洗脫劑平衡后，在床頂部留下數(shù)毫升洗脫劑，再用滴管 輕輕沿柱壁將試樣 加入至 柱的上面，防止擾動填充層表面 ，打開柱底部的流出口，使樣品液滲入凝膠床內(nèi)。這一步關(guān)鍵是既 要使樣品恰好全部滲入凝膠床，又不致使凝膠表面干燥而發(fā)生裂縫。 非水溶性物質(zhì)的洗脫采用有機溶劑（如苯和丙酮），
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