生化分離技術(shù)第七章_層析技術(shù)-閱讀頁
2025-01-27 15:34本頁面
【正文】 水溶性物質(zhì)的洗脫一般采用水或具有不同離子強度和 pH的緩沖液。多糖類物質(zhì)的洗脫以水為最佳，有時為了使樣品溶液解度增加而使用含鹽洗脫劑。交聯(lián)葡萄糖凝膠柱可用 ，聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠由于遇酸、堿不穩(wěn)定，常用 NaCl處理。 經(jīng)常使用的凝膠以濕態(tài)保存為主 ， 只要在其中加入適當(dāng)?shù)囊志鷦┚涂煞胖脦讉€月至一年 ， 不需要干燥 。 3．凝膠過濾介質(zhì) 凝膠過濾層析常用于蛋白質(zhì)等生物大分子的分級分離和除鹽 。 商品化的凝膠過濾介質(zhì)除部分機械強度較高外 ， 大部分為軟凝膠 ， 耐壓能力較低 ， 但均能滿足上述 ① ～ ③ 項的要求 。Sephadex G是利用葡聚糖 (右旋糖酐 )交聯(lián)制備的 ， 交聯(lián)劑一般采用環(huán)氧氯丙烷 。 Sephadex凝膠按交聯(lián)度大小 ， 分 Gl0～ G200共八種型號 。 圖 77交聯(lián)葡聚糖網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) 圖 78瓊脂糖凝膠結(jié)構(gòu) 瓊脂糖凝膠是另一種較常使用的凝膠過濾介質(zhì)，其骨架結(jié)構(gòu)如圖78所示。Sepharose CL是利用環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)制備的瓊脂糖凝膠，機械強度較普通 Sepharose高。 除上述兩種常用的凝膠外 ， 聚丙烯酰胺凝膠也常使用 。 圖 79是 — 例利用高效 GFC分離骨髓血清蛋白質(zhì)的結(jié)果。例如，青霉素的致敏作用 — 般認為是產(chǎn)品中存在的一些高分子雜質(zhì)所致，如青霉素聚合物和青霉素降解產(chǎn)物青霉烯酸與蛋白質(zhì)相結(jié)合形成的青毒噻唑蛋白，它們都是具有強烈致敏性的抗原。 圖 79 高效 GFC分離骨髓血清蛋白質(zhì)的結(jié)果 2．脫鹽 GFC在生物分離領(lǐng)域的另一主要用途是生物大分子溶液的脫鹽 ， 以及除去其中的低相對分于質(zhì)量物質(zhì) 。 此外 ， GFC還用于溶解目標(biāo)產(chǎn)物的緩沖液的交換 。 若將緩沖液 A換成緩沖液 B， 可先用 B液沖洗 GFC柱 ， 上樣后用 B液洗脫 ， 即可完成緩沖液的交換 。 首先用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)如細胞色素C(12500， 指分子量 ， 下同 )、 肌紅蛋白 (16900)、 胰凝乳蛋白酶 (23200)、 卵白蛋白 (45000)和血紅蛋白 (64500)等分別進行凝膠過濾層析實驗 ， 確定分配系數(shù)與相對分子質(zhì)量的關(guān)系式 。 不過 ， GFC僅對球形分子的測量精度較高 ， 對分子形狀為棒狀的物質(zhì) ， 測量值將小于實際值 。因此可采用恒定洗脫法洗脫展開，操作條件溫和，產(chǎn)品收率可接近 100％； ② 每批操作結(jié)束后不需要進行介質(zhì)的清洗或再生 ， 故容易實施循環(huán)操作 ， 提高產(chǎn)品純度 。 離子交換層析的操作 離子交換層析的裝置主要包括蠕動泵、離子交換層析柱、紫外檢測器及部分收集器等。 洗脫 ? IEC操作很少采用恒定洗脫法，而多采用流動相離子強度線性增大的線性梯度洗脫法(1inear gradient e1ution)或離子強度階躍增大的逐次洗脫法 (step wise elution)。 ? 在實際層析操作中，如果料液組成未知，一般應(yīng)首先采用線性梯度洗脫法，確定各種組分的分配特性以及層析操作的條件。溶解樣品的初始緩沖液離子強度要低，層析展開用的洗脫劑離子強度可升高。陽離子交換劑的洗脫 pH由低到高，陰離子交換劑的洗脫 pH由高到低。 疏水性吸附劑 ? 各種凝膠過濾介質(zhì)經(jīng)偶聯(lián)疏水性配基后均可用作疏水性吸附劑。疏水性配基與親水性固定相粒子之間的偶聯(lián)主要利用氨基或醚鍵結(jié)合。 ? 實驗結(jié)束后，吸附劑需要再生 ：用蒸餾水、乙醇、正丁醇、乙醇、蒸餾水依次洗滌，裝柱，用初始緩沖液平衡吸附劑。 影響疏水性吸附的因素 ? 離子強度及種類 ：蛋白質(zhì)的疏水性吸附作用隨離子強度提高而增大。高價陰離子的鹽析作用較大。 ? 破壞水化作用的物質(zhì) ： SCN、 CLO4和 I等離子半徑較大、電荷密度低的陰離子可減弱水分子之間相互作用，使疏水性吸附減弱，蛋白質(zhì)易于洗脫 。 第五節(jié) 親和層析 ? 親和層析的原理 依據(jù)生物高分子物質(zhì)能與相應(yīng)專一配基分子可逆結(jié)合的原理，采用一定技術(shù)，把與目的產(chǎn)物具有特異親和力的生物分子固定化后作為固定相，則含有目的產(chǎn)物的混合物（流動相）流經(jīng)此固定相后，可把目的產(chǎn)物從混合物中分離出來，此中分離技術(shù)稱為親和層析。 ? 為了減小吸附操作中的非特異性吸附，所用的緩沖液的離子強度要適當(dāng)，緩沖液的 pH應(yīng)使配基與目標(biāo)產(chǎn)物及雜質(zhì)的靜電作用較小。提高流速雖可加快分離速度，但會降低柱效。 ? 清洗操作目的是洗去介質(zhì)顆粒內(nèi)部和顆粒間空隙中的雜質(zhì)，一般使用與吸附時相同的緩沖液 。 ? 洗脫結(jié)束后，親和柱仍需繼續(xù)用洗脫劑洗滌，直到無親和物存在為止，再用平衡緩沖液充分平衡親和柱，以備下次使用。非特異性洗脫通過調(diào)節(jié)洗脫液的 pH、離子強度、離子種類或溫度等降低目標(biāo)產(chǎn)物的親和吸附作用。 RPC中溶質(zhì)也通過疏水性相互作用分配于固定相表面，但是 RPC固定相表面完全被非極性基團所覆蓋，表現(xiàn)強烈的疏水性。 影響因素 ? 溶質(zhì)在反相介質(zhì)上的分配系數(shù)取決于溶質(zhì)的疏水性，一般疏水性越大，分配系數(shù)越大。因此 RPC多采用降低流動相極性 (水含量 )的線性梯度洗脫法。由于反相介質(zhì)表面為強烈疏水性，并且流動相為低極性有機溶劑，生物活性大分子在 RPC分離過程中容易變性失活。
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