生化分離技術第七章_層析技術(文件)
【正文】 在凝膠過濾介質的分級范圍內蛋白質的分配系數(shù) (或洗脫體積 )與相對分子質量的對數(shù)呈線性關系 ， 所以 GFC可用于未知物質相對分子質量的測定 。 凝膠層析的特點 ①溶質與介質不發(fā)生任何形式的相互作用。進行層析時，先將樹脂用展開劑處理，使樹脂層析劑轉變成展開劑離子的型式；然后將溶解在少量溶劑（通常為展開劑）中的試樣加到層析柱的上部，再通入展開劑展開，流出液分步收集，測定其含量。 ? 選擇合適的離子交換劑是操作關鍵，另外離子交換層析緩沖液的選擇也很重要。 第四節(jié) 疏水性相互作用層析 ? 疏水性相互作用層析的原理 疏水性相互作用層析 (Hydrophobic interaction chromatography， HIC)是利用表面偶聯(lián)弱疏水性基團 (疏水性配基 )的疏水性吸附劑為固定相，根據(jù)蛋白質與疏水性吸附劑之間的弱疏水性相互作用的差別進行蛋白質類生物大分子分離純化的洗脫層析法。 疏水性相互作用層析的操作 ? 基本操作同其它層析柱 ? 為了有效地洗脫吸附劑上的生物大分子，可以用下列的一種或幾種方法：①改換一種具有較低鹽析效應的離子；②降低離子強度；③減弱洗脫劑的極性，也可加入乙二醇；④用含有表面活性劑的洗脫劑；⑤提高洗脫劑的 pH。除離子強度外，離子的種類亦影響蛋白質的疏水性吸附。 ? 乙二醇和丙三醇等含羥基的物質也具有影響水化的作用，降低蛋白質的疏水性吸附作用 ? 表面活性劑 ：表面活性劑可與吸附劑及蛋白質的疏水部位結合，從而減弱蛋白質的疏水性吸附。 ? 料液流速是影響層析速度和效果的重要因素。 ? 目標產物的洗脫方法有特異性洗脫和非特異性洗脫。 第六節(jié) 反相層析 ? 反相層析 (Reversed— phase chromatography，RPC)是利用非極性的反相介質為固定相，極性有機溶劑的水溶液為流動相，根據(jù)溶質極性 (疏水性 )的差別進行溶質分離純化的洗脫層析法。 ? 流動相的極性越大，溶質的分配系數(shù)越大。 ? 反相介質性能穩(wěn)定，分離效率高，可分離蛋白質、肽、氨基酸、核酸、脂類、脂肪酸、糖類、植物堿等含有非極性基團的各種物質。 ? 應用 ? RPC主要用于相對分子質量低于 5000，特別是1000以下的非極性小分子物質的分析和純化，也可用于蛋白質等生物大分子的分析和純化。因此，必須采用極性有機溶劑（如甲醇、乙氰等）或其水溶液進行溶質的洗脫分離。 ? 特異性洗脫劑含有與親和配基或目標產物具有親和結合作用的小分子化合物，通過與親和配基或目標產物的競爭性結合，洗脫目標產物。此外，瓊脂糖容易受壓變形，壓力過大反而流速降低。 親和層析示意圖 圖 713 親和色譜分離示意圖 親和層析的操作 ? 親和層析包括進料吸附、清洗、洗脫和介質再生幾個步驟 。疏水性吸附與鹽析沉淀一樣，在高價陰離子的存在下作用力較高。吸附劑經(jīng)再生后可反復使用。常用的疏水性配基主要有苯基、短鏈烷基 (c3~c8)、烷氨基、聚乙二醇和聚醚等。使用梯度洗脫時，離子強度逐漸增加。 在線性梯度洗脫和逐次洗脫過程中， IEC柱內溶質區(qū)帶后部的離子強度高于前部，因此區(qū)帶后部的移動速度高于前部，溶質在洗脫過程中得到濃縮。 第三節(jié) 離子交換層析 ? 離子交換層析的原理 離子交換層析 (Ion exchange chromatography， IEC)是利用離子交換劑為固定相，根據(jù)荷電溶質與離子交換劑之間靜電相互作用力的不同而發(fā)生差速遷移，從而實現(xiàn)溶質分離的洗脫層析法 。然后測定未知物質的洗脫體積 (分配系數(shù) )， 就可推算其相對分子質量 。 生物物質的分離純化需要多步操作 ， 上一步操作所用緩沖液有時不適合于下一步單元操作的有效實施 (例如 ， 某些鹽離子抑制蛋白質在親和吸咐劑上的吸附 )， 必須進行緩沖液的交換 。利用Sephadex G25凝膠柱處理青霉素溶液可除去這類高分子雜質。 二 、 凝膠層析的應用及特點 1． 分離純化 GFC可用于相對分子質量從幾百到 l06數(shù)量級的物質的分離純化 ， 是蛋白質 、 肽 、 脂質 、 抗生素 、 糖類 、 核酸以及病毒 (50 nm ～ 400nm)的分離與分析中頻繁使用的液相層析法 。 第二節(jié) 凝膠過濾層析 Sepharose是常用的瓊脂糖凝膠品牌之一，機械強度較低。 原料中環(huán)氧氯丙烷用量越大 ， 交聯(lián)度越高 ， 凝膠的網(wǎng)狀結構越緊密 ， 吸水量越小 。 因此 ， 良好凝膠過濾介質應滿足以下要求： ① 親水性高 ， 表面惰性 ， 即介質與溶質之間不發(fā)生任何化學或物理相互作用； ② 穩(wěn)定性強 ， 在較寬的 pH和離子強度范圍以及化學試劑中保持穩(wěn)定 ， 使用壽命長； ③ 具有一定的孔徑分布范圍； ④ 機械強度高 ， 允許較高的操作壓力 (流速 )。 為了抑制微生物在凝膠層內生長 ， 在凝膠床保存之前必須完全除去磷酸根離子和所有底物 ， 將柱真空保存或低溫保存 ， 但溫度不可過低 ， 離子強度要高一些 ， 以防凍結 。 PH的影響與被分離物質的酸堿性有關，在酸性 pH時堿性物質易于洗脫，在堿性 pH時酸性物質易于洗脫。當樣品液面恰與凝膠床表面平時
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