生化分離技術(shù)第七章_層析技術(shù)(文件)
【正文】 在凝膠過濾介質(zhì)的分級范圍內(nèi)蛋白質(zhì)的分配系數(shù) (或洗脫體積 )與相對分子質(zhì)量的對數(shù)呈線性關(guān)系 ， 所以 GFC可用于未知物質(zhì)相對分子質(zhì)量的測定 。 凝膠層析的特點 ①溶質(zhì)與介質(zhì)不發(fā)生任何形式的相互作用。進行層析時，先將樹脂用展開劑處理，使樹脂層析劑轉(zhuǎn)變成展開劑離子的型式；然后將溶解在少量溶劑（通常為展開劑）中的試樣加到層析柱的上部，再通入展開劑展開，流出液分步收集，測定其含量。 ? 選擇合適的離子交換劑是操作關(guān)鍵，另外離子交換層析緩沖液的選擇也很重要。 第四節(jié) 疏水性相互作用層析 ? 疏水性相互作用層析的原理 疏水性相互作用層析 (Hydrophobic interaction chromatography， HIC)是利用表面偶聯(lián)弱疏水性基團 (疏水性配基 )的疏水性吸附劑為固定相，根據(jù)蛋白質(zhì)與疏水性吸附劑之間的弱疏水性相互作用的差別進行蛋白質(zhì)類生物大分子分離純化的洗脫層析法。 疏水性相互作用層析的操作 ? 基本操作同其它層析柱 ? 為了有效地洗脫吸附劑上的生物大分子，可以用下列的一種或幾種方法：①改換一種具有較低鹽析效應(yīng)的離子；②降低離子強度；③減弱洗脫劑的極性，也可加入乙二醇；④用含有表面活性劑的洗脫劑；⑤提高洗脫劑的 pH。除離子強度外，離子的種類亦影響蛋白質(zhì)的疏水性吸附。 ? 乙二醇和丙三醇等含羥基的物質(zhì)也具有影響水化的作用，降低蛋白質(zhì)的疏水性吸附作用 ? 表面活性劑 ：表面活性劑可與吸附劑及蛋白質(zhì)的疏水部位結(jié)合，從而減弱蛋白質(zhì)的疏水性吸附。 ? 料液流速是影響層析速度和效果的重要因素。 ? 目標(biāo)產(chǎn)物的洗脫方法有特異性洗脫和非特異性洗脫。 第六節(jié) 反相層析 ? 反相層析 (Reversed— phase chromatography，RPC)是利用非極性的反相介質(zhì)為固定相，極性有機溶劑的水溶液為流動相，根據(jù)溶質(zhì)極性 (疏水性 )的差別進行溶質(zhì)分離純化的洗脫層析法。 ? 流動相的極性越大，溶質(zhì)的分配系數(shù)越大。 ? 反相介質(zhì)性能穩(wěn)定，分離效率高，可分離蛋白質(zhì)、肽、氨基酸、核酸、脂類、脂肪酸、糖類、植物堿等含有非極性基團的各種物質(zhì)。 ? 應(yīng)用 ? RPC主要用于相對分子質(zhì)量低于 5000，特別是1000以下的非極性小分子物質(zhì)的分析和純化，也可用于蛋白質(zhì)等生物大分子的分析和純化。因此，必須采用極性有機溶劑（如甲醇、乙氰等）或其水溶液進行溶質(zhì)的洗脫分離。 ? 特異性洗脫劑含有與親和配基或目標(biāo)產(chǎn)物具有親和結(jié)合作用的小分子化合物，通過與親和配基或目標(biāo)產(chǎn)物的競爭性結(jié)合，洗脫目標(biāo)產(chǎn)物。此外，瓊脂糖容易受壓變形，壓力過大反而流速降低。 親和層析示意圖 圖 713 親和色譜分離示意圖 親和層析的操作 ? 親和層析包括進料吸附、清洗、洗脫和介質(zhì)再生幾個步驟 。疏水性吸附與鹽析沉淀一樣，在高價陰離子的存在下作用力較高。吸附劑經(jīng)再生后可反復(fù)使用。常用的疏水性配基主要有苯基、短鏈烷基 (c3~c8)、烷氨基、聚乙二醇和聚醚等。使用梯度洗脫時，離子強度逐漸增加。 在線性梯度洗脫和逐次洗脫過程中， IEC柱內(nèi)溶質(zhì)區(qū)帶后部的離子強度高于前部，因此區(qū)帶后部的移動速度高于前部，溶質(zhì)在洗脫過程中得到濃縮。 第三節(jié) 離子交換層析 ? 離子交換層析的原理 離子交換層析 (Ion exchange chromatography， IEC)是利用離子交換劑為固定相，根據(jù)荷電溶質(zhì)與離子交換劑之間靜電相互作用力的不同而發(fā)生差速遷移，從而實現(xiàn)溶質(zhì)分離的洗脫層析法 。然后測定未知物質(zhì)的洗脫體積 (分配系數(shù) )， 就可推算其相對分子質(zhì)量 。 生物物質(zhì)的分離純化需要多步操作 ， 上一步操作所用緩沖液有時不適合于下一步單元操作的有效實施 (例如 ， 某些鹽離子抑制蛋白質(zhì)在親和吸咐劑上的吸附 )， 必須進行緩沖液的交換 。利用Sephadex G25凝膠柱處理青霉素溶液可除去這類高分子雜質(zhì)。 二 、 凝膠層析的應(yīng)用及特點 1． 分離純化 GFC可用于相對分子質(zhì)量從幾百到 l06數(shù)量級的物質(zhì)的分離純化 ， 是蛋白質(zhì) 、 肽 、 脂質(zhì) 、 抗生素 、 糖類 、 核酸以及病毒 (50 nm ～ 400nm)的分離與分析中頻繁使用的液相層析法 。 第二節(jié) 凝膠過濾層析 Sepharose是常用的瓊脂糖凝膠品牌之一，機械強度較低。 原料中環(huán)氧氯丙烷用量越大 ， 交聯(lián)度越高 ， 凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越緊密 ， 吸水量越小 。 因此 ， 良好凝膠過濾介質(zhì)應(yīng)滿足以下要求： ① 親水性高 ， 表面惰性 ， 即介質(zhì)與溶質(zhì)之間不發(fā)生任何化學(xué)或物理相互作用； ② 穩(wěn)定性強 ， 在較寬的 pH和離子強度范圍以及化學(xué)試劑中保持穩(wěn)定 ， 使用壽命長； ③ 具有一定的孔徑分布范圍； ④ 機械強度高 ， 允許較高的操作壓力 (流速 )。 為了抑制微生物在凝膠層內(nèi)生長 ， 在凝膠床保存之前必須完全除去磷酸根離子和所有底物 ， 將柱真空保存或低溫保存 ， 但溫度不可過低 ， 離子強度要高一些 ， 以防凍結(jié) 。 PH的影響與被分離物質(zhì)的酸堿性有關(guān)，在酸性 pH時堿性物質(zhì)易于洗脫，在堿性 pH時酸性物質(zhì)易于洗脫。當(dāng)樣品液面恰與凝膠床表面平時
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