生化分離技術(shù)第七章_層析技術(shù)-全文預(yù)覽
【正文】 ，加入數(shù)毫升洗脫劑沖洗管壁。 凝膠要懸浮在洗脫劑中 ， 在攪拌下緩慢加入柱中 ， 使凝膠自然沉積 ， 直到所需高度為止 。 2． 凝膠層析的操作 （ 1）凝膠的處理 葡聚糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠上以干品出售的，所以在使用前必須溶脹。 如圖 76所示 ， 在裝填具有一定孔徑分布的凝膠過(guò)濾介質(zhì)的層析柱中 ， 料液中溶質(zhì) 1的相對(duì)分子質(zhì)量很大 ， 不能進(jìn)入到凝膠的細(xì)孔中 ， 因而從凝膠間的床層空隙流過(guò) ， 洗脫體積為層析柱的空隙體積；對(duì)子溶質(zhì) 4， 其相對(duì)分子質(zhì)量很小 ，能夠進(jìn)入到凝膠的所有細(xì)孔中 ， 因而其洗脫體積接近柱體積；相對(duì)分子質(zhì)量介于溶質(zhì) 1和溶質(zhì) 4之間的溶質(zhì) 2和 3可進(jìn)入到凝膠的部分細(xì)孔中 ， 故其洗脫體積介于空隙體積和柱體積之間 ， 根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的差別 （ 溶質(zhì) 2的相對(duì)分子質(zhì)量大于溶質(zhì) 3） 順序洗脫 。 3． 壓力 在以固體 (包括以固體為載體的液體薄層 )為固定相的液相層析中 ， 根據(jù)操作壓力的不同 ， 又分為低壓 (壓力一般小于)、 中壓 (壓力為 ～ 40MPa)和高壓 (壓力為 ～40MPa)液相層析法 。而固定相有 固體、液體和以固體為載體的液體薄層。理論塔板數(shù)的多少可反映色譜柱分離性能的優(yōu)劣。 2121( ) / 2RRttRWW??? 根據(jù)分離度 R的大小可以判斷被物質(zhì)在色譜柱中的分離情況； R值越大，兩色譜峰的距離越遠(yuǎn)，分離效果就越好， 如圖 75所示。 標(biāo)準(zhǔn)偏差、峰寬與半高峰寬的單位由色譜峰橫坐標(biāo)單位而定，可以是時(shí)間、體積或距離等。 ②半高峰寬 W1/2 即 1/2峰高處的峰寬。 相對(duì)保留值 r2,1可以消除某些操作條件對(duì)保留值的影響，只要柱溫、固定相和流動(dòng)相的性質(zhì)保持不變，即使填充情況、柱長(zhǎng)、柱徑及流動(dòng)相流速有所變化，相對(duì)保留值仍保持不變。其定義式為： tR′ = tR t0 ⑥ 校正保留體積 VR′ 扣除死體積后的保留體積稱為校正保留體積（或調(diào)整保留體積）；其定義式為： VR′ = VR– V0 VR′ 與 tR′ 之間的關(guān)系為： VR′ = tR′ Fc 死體積 V0反映了色譜柱的幾何特性，它與被測(cè)物質(zhì)的性質(zhì)無(wú)關(guān)。 ③死時(shí)間 t0 不被固定相滯留的組分（氣相色譜中如空氣、甲烷等），從開(kāi)始進(jìn)樣到柱出口處出現(xiàn)濃度最大值時(shí)所需的時(shí)間稱為死時(shí)間，其值等于流動(dòng)相流經(jīng)色譜柱的時(shí)間，如圖 73所示。 (a) (b) (c) 圖 74 峰形示意圖 （ 4）保留值 表示混合物中各組分在色譜柱中停留時(shí)間或?qū)⒔M分帶出色譜柱所需流動(dòng)相體積的數(shù)值，稱為保留值?；€反映了操作條件下，檢測(cè)器系統(tǒng)噪聲隨時(shí)間變化的波動(dòng)情況，穩(wěn)定的基線應(yīng)是一條平行于橫坐標(biāo)的直線。 3．色譜圖及基本概念 混合液中各組分經(jīng)色譜柱分離后，隨流動(dòng)相依次流出色譜柱進(jìn)入檢測(cè)器，檢測(cè)器的響應(yīng)信號(hào) — 時(shí)間曲線或檢測(cè)器的響應(yīng)信號(hào) — 流動(dòng)相體積曲線，稱為色譜流出曲線，又稱色譜圖， 如圖 73所示。 平衡系數(shù) K主要與下列因素有關(guān)： ① 被分離物質(zhì)本身的性質(zhì)； ② 固定相和流動(dòng)相的性質(zhì)； ③ 色譜柱的操作溫度 。因此當(dāng)流動(dòng)相 移動(dòng)一定柱長(zhǎng)后，使各 組分在層析柱內(nèi)分層，從而達(dá)到各組分分離的目的。典型的柱層析分離設(shè)備示于圖 71中。 第一節(jié) 層析的基本原理及分類 一 、 層析的基本原理 層析是根據(jù)混合物中溶質(zhì)在互不混溶的兩相之間分配行為的差別，引起移動(dòng)速度的不同而進(jìn)行分離的方法。由于各組分在固定相中的分配系數(shù)（或溶解、吸附、交換、滲透或親和能力）的差異，使各組分隨流動(dòng)相移動(dòng)的速率不同，分配系數(shù)大的溶質(zhì)在固定相上存在的幾率大，隨流動(dòng)相移動(dòng)的速度小。 其表達(dá)通式可寫為： （ 71） smCKC?式中 K—— 平衡系數(shù)（分配系數(shù)、吸附系數(shù)、選擇性系數(shù)等）； Cs—— 固定相中的濃度； Cm—— 流動(dòng)相中的濃度。 設(shè)體積為 V的流動(dòng)相流過(guò)色譜系統(tǒng)，流速很慢，可以認(rèn)為溶質(zhì)在兩相間平衡，則： msVVA K A?? ?溶 質(zhì) 移 動(dòng) 距 離 能 進(jìn) 行 分 配 的 有 效 截 面 積流動(dòng)相移動(dòng)距離 = V/Am mfmsARA KA? ? 由阻滯因數(shù)的定義式可得： 因此，當(dāng) Am、 As一定時(shí)（與裝柱時(shí)的緊密程度有關(guān)），一定的平衡系數(shù) K有相應(yīng)的 Rf值。使基線發(fā)生細(xì)小波動(dòng)的現(xiàn)象稱為噪音，如圖 73中的空氣峰。但實(shí)際上，流出曲線并非完全對(duì)稱，不正常的色譜峰有拖尾峰和前伸峰，如圖 74(b)、 (c)所示。 ②保留體積 VR 從開(kāi)始進(jìn)樣到柱出口處被測(cè)組分出現(xiàn)濃度最
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