生化分離技術(shù)第七章_層析技術(shù)-免費(fèi)閱讀
【正文】 因此 RPC多采用降低流動(dòng)相極性 (水含量 )的線性梯度洗脫法。 ? 洗脫結(jié)束后，親和柱仍需繼續(xù)用洗脫劑洗滌，直到無(wú)親和物存在為止，再用平衡緩沖液充分平衡親和柱，以備下次使用。 第五節(jié) 親和層析 ? 親和層析的原理 依據(jù)生物高分子物質(zhì)能與相應(yīng)專一配基分子可逆結(jié)合的原理，采用一定技術(shù)，把與目的產(chǎn)物具有特異親和力的生物分子固定化后作為固定相，則含有目的產(chǎn)物的混合物（流動(dòng)相）流經(jīng)此固定相后，可把目的產(chǎn)物從混合物中分離出來(lái)，此中分離技術(shù)稱為親和層析。 ? 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，吸附劑需要再生 ：用蒸餾水、乙醇、正丁醇、乙醇、蒸餾水依次洗滌，裝柱，用初始緩沖液平衡吸附劑。溶解樣品的初始緩沖液離子強(qiáng)度要低，層析展開(kāi)用的洗脫劑離子強(qiáng)度可升高。因此可采用恒定洗脫法洗脫展開(kāi)，操作條件溫和，產(chǎn)品收率可接近 100％； ② 每批操作結(jié)束后不需要進(jìn)行介質(zhì)的清洗或再生 ， 故容易實(shí)施循環(huán)操作 ， 提高產(chǎn)品純度 。 此外 ， GFC還用于溶解目標(biāo)產(chǎn)物的緩沖液的交換 。 除上述兩種常用的凝膠外 ， 聚丙烯酰胺凝膠也常使用 。Sephadex G是利用葡聚糖 (右旋糖酐 )交聯(lián)制備的 ， 交聯(lián)劑一般采用環(huán)氧氯丙烷 。交聯(lián)葡萄糖凝膠柱可用 ，聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠由于遇酸、堿不穩(wěn)定，常用 NaCl處理。 （ 3）上樣和洗脫 柱床經(jīng)洗脫劑平衡后，在床頂部留下數(shù)毫升洗脫劑，再用滴管 輕輕沿柱壁將試樣 加入至 柱的上面，防止擾動(dòng)填充層表面 ，打開(kāi)柱底部的流出口，使樣品液滲入凝膠床內(nèi)。因此， GFC操作一般采用組成一定的洗脫液進(jìn)行洗脫展開(kāi)，這種洗脫法稱為恒定洗脫法 (isocratIc elution)。 紙層析和薄層層析多用于分析目的 ， 而柱層析易于放大 ， 適用于大量制備分離 ， 是主要的層析分離手段 。這一小段色譜柱可看成是一個(gè)理論塔板，相當(dāng)于精餾操作中的一塊理論塔板，一個(gè)理論塔板所對(duì)應(yīng)的色譜柱的長(zhǎng)度稱為理論塔板高度（理論板高），一個(gè)色譜柱可包含若干個(gè)理論塔板。它與標(biāo)準(zhǔn)偏差的關(guān)系為： W = 4σ。 ,其定義式為： （ 72） 式中 t′R t′R1 —— 分別為被測(cè)物質(zhì)和參比物質(zhì)的校正保留時(shí)間； V′R V′R2 —— 分別為被測(cè)物質(zhì)和參比物質(zhì)的校正保留體積。 ②保留體積 VR 從開(kāi)始進(jìn)樣到柱出口處被測(cè)組分出現(xiàn)濃度最大值時(shí)所通過(guò)的流動(dòng)相體積，稱為保留體積。使基線發(fā)生細(xì)小波動(dòng)的現(xiàn)象稱為噪音，如圖 73中的空氣峰。 其表達(dá)通式可寫為： （ 71） smCKC?式中 K—— 平衡系數(shù)（分配系數(shù)、吸附系數(shù)、選擇性系數(shù)等）； Cs—— 固定相中的濃度； Cm—— 流動(dòng)相中的濃度。 第一節(jié) 層析的基本原理及分類 一 、 層析的基本原理 層析是根據(jù)混合物中溶質(zhì)在互不混溶的兩相之間分配行為的差別，引起移動(dòng)速度的不同而進(jìn)行分離的方法。因此當(dāng)流動(dòng)相 移動(dòng)一定柱長(zhǎng)后，使各 組分在層析柱內(nèi)分層，從而達(dá)到各組分分離的目的。 3．色譜圖及基本概念 混合液中各組分經(jīng)色譜柱分離后，隨流動(dòng)相依次流出色譜柱進(jìn)入檢測(cè)器，檢測(cè)器的響應(yīng)信號(hào) — 時(shí)間曲線或檢測(cè)器的響應(yīng)信號(hào) — 流動(dòng)相體積曲線，稱為色譜流出曲線，又稱色譜圖， 如圖 73所示。 (a) (b) (c) 圖 74 峰形示意圖 （ 4）保留值 表示混合物中各組分在色譜柱中停留時(shí)間或?qū)⒔M分帶出色譜柱所需流動(dòng)相體積的數(shù)值，稱為保留值。其定義式為： tR′ = tR t0 ⑥ 校正保留體積 VR′ 扣除死體積后的保留體積稱為校正保留體積（或調(diào)整保留體積）；其定義式為： VR′ = VR– V0 VR′ 與 tR′ 之間的關(guān)系為： VR′ = tR′ Fc 死體積 V0反映了色譜柱的幾何特性，它與被測(cè)物質(zhì)的性質(zhì)無(wú)關(guān)。 ②半高峰寬 W1/2 即 1/2峰高處的峰寬。 2121( ) / 2RRttRWW??? 根據(jù)分離度 R的大小可以判斷被物質(zhì)在色譜柱中的分離情況； R值越大，兩色譜峰的距離越遠(yuǎn)，分離效果就越好， 如圖 75所示。而固定相有 固體、液體和以固體為載體的液體薄層。 如圖 76所示 ， 在裝填具有一定孔徑分布的凝膠過(guò)濾介質(zhì)的層析柱中 ， 料液中溶質(zhì) 1的相對(duì)分子質(zhì)量很大 ， 不能進(jìn)入到凝膠的細(xì)孔中 ， 因而從凝膠間的床層空隙流過(guò) ， 洗脫體積
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