生化分離技術(shù)第七章_層析技術(shù)-文庫(kù)吧在線文庫(kù)
【正文】 f， 其定義式可寫(xiě)為： ( r )( R )fR ??溶 質(zhì) （ 濃 度 中 心 ） 的 移 動(dòng) 速 度 溶 質(zhì) （ 濃 度 中 心 ） 的 移 動(dòng) 距 離流 動(dòng) 相 的 移 動(dòng) 速 度 在 同 一 時(shí) 間 流 動(dòng) 相 前 沿 的 移 動(dòng) 距 離 令 As為固定相平均截面積， Am為流動(dòng)相平均截面積，則系統(tǒng)或柱的總截面積 At=As+Am。 固定相填充于柱中，在柱的頂端(入口 )加入一定量的料液后，連續(xù)輸入流動(dòng)相，料液中的溶質(zhì)在流動(dòng)相和固定相之間發(fā)生擴(kuò)散傳質(zhì)，產(chǎn)生分配平衡。 圖 71柱層析分離設(shè)備 1．分離理論基礎(chǔ) 互不混溶的兩相分別稱(chēng)為固定相 (stationary phase)和流動(dòng)相 (mobile phase)。一般情況下 ， 溫度與平衡系數(shù)成反比 ， 各組分平衡系數(shù) K的差異程度決定了色譜分離的效果 ， K值差異越大 ， 色譜分離效果越理想 。 圖 73 色譜圖 （ 2）色譜峰 當(dāng)樣品中的組分隨流動(dòng)相流入檢測(cè)器時(shí)，檢測(cè)器的響應(yīng)信號(hào)大小隨時(shí)間變化所形成的峰形曲線稱(chēng)為色譜峰，峰的起點(diǎn)和終點(diǎn)的連接直線稱(chēng)為峰底。 ④ 死體積 V0 不被固定相滯留的組分，從進(jìn)樣到出現(xiàn)最大峰值所需流動(dòng)相的體積，稱(chēng)為死體積。 222 ,111RRRRtVrtV?????? （ 5）峰高與峰面積 色譜峰頂點(diǎn)與峰底之間的垂直距離稱(chēng)為峰高，用 h表示；峰與峰底之間的面積稱(chēng)為峰面積，用 A表示，可作為定量分析的參數(shù)。在理想的色譜中，組分的譜帶應(yīng)是很窄的，若譜帶較寬，將直接導(dǎo)致分離效果下降。單位長(zhǎng)度色譜柱內(nèi)包含的理論塔板數(shù)越多，流動(dòng)相通過(guò)的塔板數(shù)也越多，說(shuō)明流動(dòng)相流過(guò)色譜柱的平衡次數(shù)越多，色譜柱的分離效率就越高。 高壓液相層析法中層析介質(zhì) （ 固定相 ）微細(xì) ， 分離精度高 、 速度快 ， 主要用于成分分析 。可以將它們浸泡在洗脫劑中，慢慢攪拌。這一步關(guān)鍵是既 要使樣品恰好全部滲入凝膠床，又不致使凝膠表面干燥而發(fā)生裂縫。 經(jīng)常使用的凝膠以濕態(tài)保存為主 ， 只要在其中加入適當(dāng)?shù)囊志鷦┚涂煞胖脦讉€(gè)月至一年 ， 不需要干燥 。 Sephadex凝膠按交聯(lián)度大小 ， 分 Gl0～ G200共八種型號(hào) 。 圖 79是 — 例利用高效 GFC分離骨髓血清蛋白質(zhì)的結(jié)果。 若將緩沖液 A換成緩沖液 B， 可先用 B液沖洗 GFC柱 ， 上樣后用 B液洗脫 ， 即可完成緩沖液的交換 。 離子交換層析的操作 離子交換層析的裝置主要包括蠕動(dòng)泵、離子交換層析柱、紫外檢測(cè)器及部分收集器等。陽(yáng)離子交換劑的洗脫 pH由低到高，陰離子交換劑的洗脫 pH由高到低。 影響疏水性吸附的因素 ? 離子強(qiáng)度及種類(lèi) ：蛋白質(zhì)的疏水性吸附作用隨離子強(qiáng)度提高而增大。 ? 為了減小吸附操作中的非特異性吸附，所用的緩沖液的離子強(qiáng)度要適當(dāng)，緩沖液的 pH應(yīng)使配基與目標(biāo)產(chǎn)物及雜質(zhì)的靜電作用較小。非特異性洗脫通過(guò)調(diào)節(jié)洗脫液的 pH、離子強(qiáng)度、離子種類(lèi)或溫度等降低目標(biāo)產(chǎn)物的親和吸附作用。由于反相介質(zhì)表面為強(qiáng)烈疏水性，并且流動(dòng)相為低極性有機(jī)溶劑，生物活性大分子在 RPC分離過(guò)程中容易變性失活。 影響因素 ? 溶質(zhì)在反相介質(zhì)上的分配系數(shù)取決于溶質(zhì)的疏水性，一般疏水性越大，分配系數(shù)越大。 ? 清洗操作目的是洗去介質(zhì)顆粒內(nèi)部和顆粒間空隙中的雜質(zhì)，一般使用與吸附時(shí)相同的緩沖液 。 ? 破壞水化作用的物質(zhì) ： SCN、 CLO4和 I等離子半徑較大、電荷密度低的陰離子可減弱水分子之間相互作用，使疏水性吸附減弱，蛋白質(zhì)易于洗脫 。疏水性配基與親水性固定相粒子之間的偶聯(lián)主要利用氨基或醚鍵結(jié)合。 ? 在實(shí)際層析操作中，如果料液組成未知，一般應(yīng)首先采用線性梯度洗脫法，確定各種組分的分配特性以及層析操作的條件。 不過(guò) ， GFC僅對(duì)球形分子的測(cè)量精度較高 ， 對(duì)分子形狀為棒狀的物質(zhì) ， 測(cè)量值將小于實(shí)際值 。 圖 79 高效 GFC分離骨髓血清蛋白質(zhì)的結(jié)果 2．脫鹽 GFC在生物分離領(lǐng)域的另一主要用途是生物大分子溶液的脫鹽 ， 以及除去其中的低相對(duì)分于質(zhì)量物質(zhì) 。Sepharose CL是利用環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)制備的瓊脂糖凝膠，機(jī)械強(qiáng)度較普通 Sepharose高。 商品化的凝膠過(guò)濾介質(zhì)除部分機(jī)械強(qiáng)度較高外 ， 大部分為軟凝膠 ， 耐壓能力較低 ， 但均能滿足上述 ① ～ ③ 項(xiàng)的要求 。多糖類(lèi)物質(zhì)的洗脫以水為最佳，有時(shí)為了使樣品溶液解度增加而使用含鹽洗脫劑。 床層要均勻 ， 不能有紋路或氣泡 。 相對(duì)分子質(zhì)量大于溶質(zhì) l和小于溶質(zhì) 4的溶質(zhì)的洗脫體積分別與溶質(zhì) 1和溶質(zhì) 4相同 。生物物質(zhì)一般存在于水溶液中，因此，生物分離主要采用液相層析法，如固定相為液體的分配層析法，如固定相為固體的吸附層析法及固定相為固定于固體表面的液體薄層（以固體為載體）的分配層析法等。當(dāng) R1時(shí)，兩峰有部分重疊；當(dāng) R = 1時(shí)，兩峰有 98%的分離；當(dāng) R = ，分離程度可達(dá) %；一般用 R = 離的標(biāo)志。它與標(biāo)準(zhǔn)偏差的關(guān)系為： W1/2 = 。保留體積 VR中扣除死體積 V0后，即校正保留體積VR′ ， 將更合理地反映被測(cè)組分的保留特點(diǎn)。保留值可作為定性分析的參數(shù)，由于計(jì)量單位的不同，分別稱(chēng)為保留時(shí)間、保留體積。色譜圖的縱坐標(biāo)為檢測(cè)器的響應(yīng)
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