生化分離技術第七章_層析技術(存儲版)
【正文】 為層析柱的空隙體積；對子溶質 4， 其相對分子質量很小 ，能夠進入到凝膠的所有細孔中 ， 因而其洗脫體積接近柱體積；相對分子質量介于溶質 1和溶質 4之間的溶質 2和 3可進入到凝膠的部分細孔中 ， 故其洗脫體積介于空隙體積和柱體積之間 ， 根據(jù)相對分子質量的差別 （ 溶質 2的相對分子質量大于溶質 3） 順序洗脫 。 凝膠要懸浮在洗脫劑中 ， 在攪拌下緩慢加入柱中 ， 使凝膠自然沉積 ， 直到所需高度為止 。 PH的影響與被分離物質的酸堿性有關，在酸性 pH時堿性物質易于洗脫，在堿性 pH時酸性物質易于洗脫。 因此 ， 良好凝膠過濾介質應滿足以下要求： ① 親水性高 ， 表面惰性 ， 即介質與溶質之間不發(fā)生任何化學或物理相互作用； ② 穩(wěn)定性強 ， 在較寬的 pH和離子強度范圍以及化學試劑中保持穩(wěn)定 ， 使用壽命長； ③ 具有一定的孔徑分布范圍； ④ 機械強度高 ， 允許較高的操作壓力 (流速 )。 第二節(jié) 凝膠過濾層析 Sepharose是常用的瓊脂糖凝膠品牌之一，機械強度較低。利用Sephadex G25凝膠柱處理青霉素溶液可除去這類高分子雜質。然后測定未知物質的洗脫體積 (分配系數(shù) )， 就可推算其相對分子質量 。 在線性梯度洗脫和逐次洗脫過程中， IEC柱內溶質區(qū)帶后部的離子強度高于前部，因此區(qū)帶后部的移動速度高于前部，溶質在洗脫過程中得到濃縮。常用的疏水性配基主要有苯基、短鏈烷基 (c3~c8)、烷氨基、聚乙二醇和聚醚等。疏水性吸附與鹽析沉淀一樣，在高價陰離子的存在下作用力較高。此外，瓊脂糖容易受壓變形，壓力過大反而流速降低。因此，必須采用極性有機溶劑（如甲醇、乙氰等）或其水溶液進行溶質的洗脫分離。 ? 反相介質性能穩(wěn)定，分離效率高，可分離蛋白質、肽、氨基酸、核酸、脂類、脂肪酸、糖類、植物堿等含有非極性基團的各種物質。 第六節(jié) 反相層析 ? 反相層析 (Reversed— phase chromatography，RPC)是利用非極性的反相介質為固定相，極性有機溶劑的水溶液為流動相，根據(jù)溶質極性 (疏水性 )的差別進行溶質分離純化的洗脫層析法。 ? 料液流速是影響層析速度和效果的重要因素。除離子強度外，離子的種類亦影響蛋白質的疏水性吸附。 第四節(jié) 疏水性相互作用層析 ? 疏水性相互作用層析的原理 疏水性相互作用層析 (Hydrophobic interaction chromatography， HIC)是利用表面偶聯(lián)弱疏水性基團 (疏水性配基 )的疏水性吸附劑為固定相，根據(jù)蛋白質與疏水性吸附劑之間的弱疏水性相互作用的差別進行蛋白質類生物大分子分離純化的洗脫層析法。進行層析時，先將樹脂用展開劑處理，使樹脂層析劑轉變成展開劑離子的型式；然后將溶解在少量溶劑（通常為展開劑）中的試樣加到層析柱的上部，再通入展開劑展開，流出液分步收集，測定其含量。 3．相對分子質量的測定 GFC中溶質的分配系數(shù) m在分級范圍內隨相對分子質量的對數(shù)值增大而線性減小 ， 分配系數(shù)與相對分子質量 Mr之間存在如下關系： m＝ ablogMr （ 71） 在凝膠過濾介質的分級范圍內蛋白質的分配系數(shù) (或洗脫體積 )與相對分子質量的對數(shù)呈線性關系 ， 所以 GFC可用于未知物質相對分子質量的測定 。 此外， GFC還可用于醫(yī)藥產業(yè)中無熱原水的制備以及低分子生物制劑中抗原性雜質的除去。圖 77為交聯(lián)葡聚糖的網狀結構示意圖 ， 其中曲線表示葡聚糖凝膠骨架 。 常用的抑菌劑有：疊氮鈉 （ %） 、 三氯丁醇 （ %～ %） 、 乙基汞硫代水揚酸鈉 (%～ %)、 苯基汞代鹽 （ 包括 、 苯基汞代乙酸鹽 、 硝酸鹽 、 硼酸鹽 ， %～ %） 。然后用大量洗脫劑洗脫，并收集相應的洗脫液。洗脫劑應具有一定的離子強度（約為 ）。 大量制備分離常用低壓或中壓液相層析法 。 （ 9）色譜流出曲線的意義 色譜峰數(shù)等于樣品中單組分的最少個數(shù)；色譜保留值是定性分析的依據(jù)；色譜峰高或面積是定量分析的依據(jù)；色譜保留值或區(qū)域寬度是色譜柱分離效能的評價指標；色譜峰間距是固定相或流動相選擇是否合適的判定依據(jù)。 （ 7）分離度 R 是指相鄰兩色譜峰保留值之差與兩組分色譜峰峰底寬度平均值之比值，即： （ 73） 式中 tR tR2—— 分別為組分 1和 2的保留時間 (也可采用其它保留值 )； W W2—— 分別為組分 1和 2的色譜峰的峰底寬度，與保留值的單位相同。 （ 6）區(qū)域寬度 色譜峰的區(qū)域寬度可衡量柱效，并且可與峰高相乘來計算峰面積，如圖 73所示。它可由死時間 t0與色譜柱出口處流動相的體積流速 Fc來計算，即 V0 = t0Fc。 （ 3）峰形 正常的色譜流出曲線為對稱于 峰尖的正態(tài)分布曲線，如圖 74(a)所示。 2．阻滯因數(shù)或比移值 Rf 在色譜柱（紙、板）中，溶質的移動速度與流動相的移動速度之比，稱為阻滯因數(shù)或比移值 R
教學課件相關推薦
鄂ICP備17016276號-1