生化分離技術(shù)第七章_層析技術(shù)(存儲(chǔ)版)
【正文】 為層析柱的空隙體積；對(duì)子溶質(zhì) 4， 其相對(duì)分子質(zhì)量很小 ，能夠進(jìn)入到凝膠的所有細(xì)孔中 ， 因而其洗脫體積接近柱體積；相對(duì)分子質(zhì)量介于溶質(zhì) 1和溶質(zhì) 4之間的溶質(zhì) 2和 3可進(jìn)入到凝膠的部分細(xì)孔中 ， 故其洗脫體積介于空隙體積和柱體積之間 ， 根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的差別 （ 溶質(zhì) 2的相對(duì)分子質(zhì)量大于溶質(zhì) 3） 順序洗脫 。 凝膠要懸浮在洗脫劑中 ， 在攪拌下緩慢加入柱中 ， 使凝膠自然沉積 ， 直到所需高度為止 。 PH的影響與被分離物質(zhì)的酸堿性有關(guān)，在酸性 pH時(shí)堿性物質(zhì)易于洗脫，在堿性 pH時(shí)酸性物質(zhì)易于洗脫。 因此 ， 良好凝膠過(guò)濾介質(zhì)應(yīng)滿足以下要求： ① 親水性高 ， 表面惰性 ， 即介質(zhì)與溶質(zhì)之間不發(fā)生任何化學(xué)或物理相互作用； ② 穩(wěn)定性強(qiáng) ， 在較寬的 pH和離子強(qiáng)度范圍以及化學(xué)試劑中保持穩(wěn)定 ， 使用壽命長(zhǎng)； ③ 具有一定的孔徑分布范圍； ④ 機(jī)械強(qiáng)度高 ， 允許較高的操作壓力 (流速 )。 第二節(jié) 凝膠過(guò)濾層析 Sepharose是常用的瓊脂糖凝膠品牌之一，機(jī)械強(qiáng)度較低。利用Sephadex G25凝膠柱處理青霉素溶液可除去這類(lèi)高分子雜質(zhì)。然后測(cè)定未知物質(zhì)的洗脫體積 (分配系數(shù) )， 就可推算其相對(duì)分子質(zhì)量 。 在線性梯度洗脫和逐次洗脫過(guò)程中， IEC柱內(nèi)溶質(zhì)區(qū)帶后部的離子強(qiáng)度高于前部，因此區(qū)帶后部的移動(dòng)速度高于前部，溶質(zhì)在洗脫過(guò)程中得到濃縮。常用的疏水性配基主要有苯基、短鏈烷基 (c3~c8)、烷氨基、聚乙二醇和聚醚等。疏水性吸附與鹽析沉淀一樣，在高價(jià)陰離子的存在下作用力較高。此外，瓊脂糖容易受壓變形，壓力過(guò)大反而流速降低。因此，必須采用極性有機(jī)溶劑（如甲醇、乙氰等）或其水溶液進(jìn)行溶質(zhì)的洗脫分離。 ? 反相介質(zhì)性能穩(wěn)定，分離效率高，可分離蛋白質(zhì)、肽、氨基酸、核酸、脂類(lèi)、脂肪酸、糖類(lèi)、植物堿等含有非極性基團(tuán)的各種物質(zhì)。 第六節(jié) 反相層析 ? 反相層析 (Reversed— phase chromatography，RPC)是利用非極性的反相介質(zhì)為固定相，極性有機(jī)溶劑的水溶液為流動(dòng)相，根據(jù)溶質(zhì)極性 (疏水性 )的差別進(jìn)行溶質(zhì)分離純化的洗脫層析法。 ? 料液流速是影響層析速度和效果的重要因素。除離子強(qiáng)度外，離子的種類(lèi)亦影響蛋白質(zhì)的疏水性吸附。 第四節(jié) 疏水性相互作用層析 ? 疏水性相互作用層析的原理 疏水性相互作用層析 (Hydrophobic interaction chromatography， HIC)是利用表面偶聯(lián)弱疏水性基團(tuán) (疏水性配基 )的疏水性吸附劑為固定相，根據(jù)蛋白質(zhì)與疏水性吸附劑之間的弱疏水性相互作用的差別進(jìn)行蛋白質(zhì)類(lèi)生物大分子分離純化的洗脫層析法。進(jìn)行層析時(shí)，先將樹(shù)脂用展開(kāi)劑處理，使樹(shù)脂層析劑轉(zhuǎn)變成展開(kāi)劑離子的型式；然后將溶解在少量溶劑（通常為展開(kāi)劑）中的試樣加到層析柱的上部，再通入展開(kāi)劑展開(kāi)，流出液分步收集，測(cè)定其含量。 3．相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定 GFC中溶質(zhì)的分配系數(shù) m在分級(jí)范圍內(nèi)隨相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值增大而線性減小 ， 分配系數(shù)與相對(duì)分子質(zhì)量 Mr之間存在如下關(guān)系： m＝ ablogMr （ 71） 在凝膠過(guò)濾介質(zhì)的分級(jí)范圍內(nèi)蛋白質(zhì)的分配系數(shù) (或洗脫體積 )與相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系 ， 所以 GFC可用于未知物質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定 。 此外， GFC還可用于醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中無(wú)熱原水的制備以及低分子生物制劑中抗原性雜質(zhì)的除去。圖 77為交聯(lián)葡聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)示意圖 ， 其中曲線表示葡聚糖凝膠骨架 。 常用的抑菌劑有：疊氮鈉 （ %） 、 三氯丁醇 （ %～ %） 、 乙基汞硫代水揚(yáng)酸鈉 (%～ %)、 苯基汞代鹽 （ 包括 、 苯基汞代乙酸鹽 、 硝酸鹽 、 硼酸鹽 ， %～ %） 。然后用大量洗脫劑洗脫，并收集相應(yīng)的洗脫液。洗脫劑應(yīng)具有一定的離子強(qiáng)度（約為 ）。 大量制備分離常用低壓或中壓液相層析法 。 （ 9）色譜流出曲線的意義 色譜峰數(shù)等于樣品中單組分的最少個(gè)數(shù)；色譜保留值是定性分析的依據(jù)；色譜峰高或面積是定量分析的依據(jù)；色譜保留值或區(qū)域?qū)挾仁巧V柱分離效能的評(píng)價(jià)指標(biāo)；色譜峰間距是固定相或流動(dòng)相選擇是否合適的判定依據(jù)。 （ 7）分離度 R 是指相鄰兩色譜峰保留值之差與兩組分色譜峰峰底寬度平均值之比值，即： （ 73） 式中 tR tR2—— 分別為組分 1和 2的保留時(shí)間 (也可采用其它保留值 )； W W2—— 分別為組分 1和 2的色譜峰的峰底寬度，與保留值的單位相同。 （ 6）區(qū)域?qū)挾? 色譜峰的區(qū)域?qū)挾瓤珊饬恐?，并且可與峰高相乘來(lái)計(jì)算峰面積，如圖 73所示。它可由死時(shí)間 t0與色譜柱出口處流動(dòng)相的體積流速 Fc來(lái)計(jì)算，即 V0 = t0Fc。 （ 3）峰形 正常的色譜流出曲線為對(duì)稱(chēng)于 峰尖的正態(tài)分布曲線，如圖 74(a)所示。 2．阻滯因數(shù)或比移值 Rf 在色譜柱（紙、板）中，溶質(zhì)的移動(dòng)速度與流動(dòng)相的移動(dòng)速度之比，稱(chēng)為阻滯因數(shù)或比移值 R
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