生化分離技術(shù)第七章_層析技術(shù)-預(yù)覽頁
【正文】 大值時所通過的流動相體積，稱為保留體積。 ⑤ 校正保留時間 tR′ 扣除死時間后的保留時間稱為校正保留時間（或調(diào)整保留時間），如圖 73所示；校正保留時間可理解為組分在固定相中實際滯留的時間。 ,其定義式為： （ 72） 式中 t′R t′R1 —— 分別為被測物質(zhì)和參比物質(zhì)的校正保留時間； V′R V′R2 —— 分別為被測物質(zhì)和參比物質(zhì)的校正保留體積。色譜峰的區(qū)域?qū)挾韧ǔＳ腥N表示方法： ①標準偏差 σ 即 。它與標準偏差的關(guān)系為： W = 4σ。 分離度 R綜合考慮了保留值的差值與峰寬兩方面的因素對柱效率的影響，可衡量色譜柱的總分離效能。這一小段色譜柱可看成是一個理論塔板，相當于精餾操作中的一塊理論塔板，一個理論塔板所對應(yīng)的色譜柱的長度稱為理論塔板高度（理論板高），一個色譜柱可包含若干個理論塔板。 二 、 層析分類 1． 流動相與固定相 層析法根據(jù)流動相的相態(tài)分氣相層析法、液相層析法和超臨界流體層析法。 紙層析和薄層層析多用于分析目的 ， 而柱層析易于放大 ， 適用于大量制備分離 ， 是主要的層析分離手段 。 第二節(jié) 凝膠過濾層析 一 、 原理與操作 1． 凝膠層析的原理 凝膠過濾層析 (Gel filtration chromatography， GFC)又稱體積排阻層析 、 分子篩層析 ， 是利用凝膠粒子 (通常稱為凝膠過濾介質(zhì) )為固定相 ， 根據(jù)料液中溶質(zhì)相對分子質(zhì)量的差別進行分離的液相層析法 。因此， GFC操作一般采用組成一定的洗脫液進行洗脫展開，這種洗脫法稱為恒定洗脫法 (isocratIc elution)。 （ 2） 裝柱 裝柱前 ， 柱的底部要先放些玻璃棉 、 玻璃細孔板等可拆卸的支持物 ， 以支持固定相 。 （ 3）上樣和洗脫 柱床經(jīng)洗脫劑平衡后，在床頂部留下數(shù)毫升洗脫劑，再用滴管 輕輕沿柱壁將試樣 加入至 柱的上面，防止擾動填充層表面 ，打開柱底部的流出口，使樣品液滲入凝膠床內(nèi)。 非水溶性物質(zhì)的洗脫采用有機溶劑（如苯和丙酮），水溶性物質(zhì)的洗脫一般采用水或具有不同離子強度和 pH的緩沖液。交聯(lián)葡萄糖凝膠柱可用 ，聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠由于遇酸、堿不穩(wěn)定，常用 NaCl處理。 3．凝膠過濾介質(zhì) 凝膠過濾層析常用于蛋白質(zhì)等生物大分子的分級分離和除鹽 。Sephadex G是利用葡聚糖 (右旋糖酐 )交聯(lián)制備的 ， 交聯(lián)劑一般采用環(huán)氧氯丙烷 。 圖 77交聯(lián)葡聚糖網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) 圖 78瓊脂糖凝膠結(jié)構(gòu) 瓊脂糖凝膠是另一種較常使用的凝膠過濾介質(zhì)，其骨架結(jié)構(gòu)如圖78所示。 除上述兩種常用的凝膠外 ， 聚丙烯酰胺凝膠也常使用 。例如，青霉素的致敏作用 — 般認為是產(chǎn)品中存在的一些高分子雜質(zhì)所致，如青霉素聚合物和青霉素降解產(chǎn)物青霉烯酸與蛋白質(zhì)相結(jié)合形成的青毒噻唑蛋白，它們都是具有強烈致敏性的抗原。 此外 ， GFC還用于溶解目標產(chǎn)物的緩沖液的交換 。 首先用標準蛋白質(zhì)如細胞色素C(12500， 指分子量 ， 下同 )、 肌紅蛋白 (16900)、 胰凝乳蛋白酶 (23200)、 卵白蛋白 (45000)和血紅蛋白 (64500)等分別進行凝膠過濾層析實驗 ， 確定分配系數(shù)與相對分子質(zhì)量的關(guān)系式 。因此可采用恒定洗脫法洗脫展開，操作條件溫和，產(chǎn)品收率可接近 100％； ② 每批操作結(jié)束后不需要進行介質(zhì)的清洗或再生 ， 故容易實施循環(huán)操作 ， 提高產(chǎn)品純度 。 洗脫 ? IEC操作很少采用恒定洗脫法，而多采用流動相離子強度線性增大的線性梯度洗脫法(1inear gradient e1ution)或離子強度階躍增大的逐次洗脫法 (step wise elution)。溶解樣品的初始緩沖液離子強度要低，層析展開用的洗脫劑離子強度可升高。 疏水性吸附劑 ? 各種凝膠過濾介質(zhì)經(jīng)偶聯(lián)疏水性配基后均可用作疏水性吸附劑。 ? 實驗結(jié)束后，吸附劑需要再生 ：用蒸餾水、乙醇、正丁醇、乙醇、蒸餾水依次洗滌，裝柱，用初始緩沖液平衡吸附劑。高價陰離子的鹽析作用較大。 第五節(jié) 親和層析 ? 親和層析的原理 依據(jù)生物高分子物質(zhì)能與相應(yīng)專一配基分子可逆結(jié)合的原理，采用一定技術(shù)，把與目的產(chǎn)物具有特異親和力的生物分子固定化后作為固定相，則含有目的產(chǎn)物的混合物（流動相）流經(jīng)此固定相后，可把目的產(chǎn)物從混合物中分離出來，此中分離技術(shù)稱為親和層析。提高流速雖可加快分離速度，但會降低柱效。 ? 洗脫結(jié)束后，親和柱仍需繼續(xù)用洗脫劑洗滌，直到無親和物存在為止，再用平衡緩沖液充分平衡親和柱，以備下次使用。 RPC中溶質(zhì)也通過疏水性相互作用分配于固定相表面，但是 RPC固定相表面完全被非極性基團所覆蓋，表現(xiàn)強烈的疏水性。因此 RPC多采用降低流動相極性 (水含量 )的線性梯度洗脫法。
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