生化分離技術(shù)第七章_層析技術(shù)(完整版)
【正文】 信號(hào)；橫坐標(biāo)為時(shí)間 t， 也可用流動(dòng)相體積 V或距離 L表示。在層析柱出口處各個(gè)溶質(zhì)的濃度變化如下圖 72所示。第七章 層析技術(shù) 第一節(jié) 層析的基本原理及分類 第二節(jié) 凝膠過(guò)濾層析 第三節(jié) 離子交換層析 第四節(jié) 疏水性相互作用層析 第五節(jié) 親和層析 第六節(jié) 反相層析 學(xué)習(xí)目標(biāo) ? 了解層析方法的分類及各種層析方法的應(yīng)用特點(diǎn)； ? 掌握層析的基本原理及各種層析方法的原理及操作； ? 能利用各種層析技術(shù)對(duì)生物物質(zhì)進(jìn)行分離純化。 圖 72 層析柱出口處各個(gè)溶質(zhì)的濃度變化 在定溫定壓條件下，當(dāng)色譜分離過(guò)程達(dá)到平衡狀態(tài)時(shí)，某種組分在固定相 S和流動(dòng)相 m中含量（濃度） C的比值，稱為平衡系數(shù) K（ 也可以是分配系數(shù)、吸附系數(shù)、選擇性系數(shù)等）。 （ 1）基線 在操作條件下，色譜柱出口處沒(méi)有組分流出，僅有純流動(dòng)相流過(guò)檢測(cè)器，此時(shí)的流出曲線稱為基線，如圖 73中 OC曲線。 ①保留時(shí)間 tR 從開(kāi)始進(jìn)樣至柱出口處被測(cè)組分出現(xiàn)濃度最大值時(shí)所需的時(shí)間，稱為保留時(shí)間，如圖 73所示。 ⑦相對(duì)保留值 r2,1 在相同的操作條件下，待測(cè)組分與參比組分的校正保留值之比，稱為相 對(duì)保留值，又稱為選擇因子。 ③ 峰寬 W 自色譜峰兩側(cè)的轉(zhuǎn)折點(diǎn)（拐點(diǎn)）處所作的切線與峰底相交于兩點(diǎn)，此兩點(diǎn)間的距離稱為峰寬。 圖 75 分離度影響示意圖 （ 8）柱效 柱效是表達(dá)色譜柱性能的一個(gè)重要參數(shù)，可用 塔板數(shù) N和塔板高度 H表示，其計(jì)算式為： 1 / 25 .5 4 ( )RtN W?LHN? 假設(shè)色譜柱的內(nèi)徑和柱內(nèi)的填料是均勻一致的，混合液流經(jīng)一小段色譜柱后，各組分在兩相間達(dá)平衡。 2．固定相的形狀 根據(jù)固定相或?qū)游鲅b置形狀的不同 ， 液相層析法又分紙層析法 ( Paper chromatography)、 薄層層析法 ( Thin— 1ayer chromatography)和柱層析法 (Column chromatography)。 第二節(jié) 凝膠過(guò)濾層析 圖 76 GFC的分離原理及洗脫曲線 GFC操作中溶質(zhì)的分配系數(shù) M只是相對(duì)分子質(zhì)量、分子形狀和凝膠結(jié)構(gòu) (孔徑分布 )的函數(shù)，與所用洗脫液的 pH值和離子強(qiáng)度等物性無(wú)關(guān)，即在一般的層析操作條件下、相對(duì)分子質(zhì)量一定的溶質(zhì)的分配系數(shù)為常數(shù)。 裝柱時(shí)要考慮凝膠的承壓能力 ， 如壓力太高 ， 凝膠會(huì)被擠壓變形而影響流速 。 （ 4）凝膠的再生和保養(yǎng) 理論上因?yàn)槟z本身不與溶質(zhì)發(fā)生作用，所以層析分離后無(wú)需再生處理，但實(shí)際操作時(shí)凝膠層常有一定的污染，必須作適當(dāng)?shù)奶幚怼? 其中 Sephadex G是最傳統(tǒng)的軟凝膠過(guò)濾介質(zhì)之一 ， 目前仍被廣泛使用 。除 GFC外，瓊脂糖凝膠經(jīng)化學(xué)修飾后主要用于離子交換層析、疏水性相互作用層析及親和層析的載體。 例如 ， 經(jīng)過(guò)鹽析沉淀獲得的蛋白質(zhì)溶液中鹽濃度很高 ， 一般不能直接進(jìn)行離子交換層析分離 ， 可首先用 GFC脫鹽 。 凝膠層析的特點(diǎn) ①溶質(zhì)與介質(zhì)不發(fā)生任何形式的相互作用。 ? 選擇合適的離子交換劑是操作關(guān)鍵，另外離子交換層析緩沖液的選擇也很重要。 疏水性相互作用層析的操作 ? 基本操作同其它層析柱 ? 為了有效地洗脫吸附劑上的生物大分子，可以用下列的一種或幾種方法：①改換一種具有較低鹽析效應(yīng)的離子；②降低離子強(qiáng)度；③減弱洗脫劑的極性，也可加入乙二醇；④用含有表面活性劑的洗脫劑；⑤提高洗脫劑的 pH。 ? 乙二醇和丙三醇等含羥基的物質(zhì)也具有影響水化的作用，降低蛋白質(zhì)的疏水性吸附作用 ? 表面活性劑 ：表面活性劑可與吸附劑及蛋白質(zhì)的疏水部位結(jié)合，從而減弱蛋白質(zhì)的疏水性吸附。 ? 目標(biāo)產(chǎn)物的洗脫方法有特異性洗脫和非特異性洗脫。 ? 流動(dòng)相的極性越大，溶質(zhì)的分配系數(shù)越大。 ? 應(yīng)用 ? RPC主要用于相對(duì)分子質(zhì)量低于 5000，特別是1000以下的非極性小分子物質(zhì)的分析和純化，也可用于蛋白質(zhì)等生物大分子的分析和純化。 ? 特異性洗脫劑含有與親和配基或目標(biāo)產(chǎn)物具有親和結(jié)合作用的小分子化合物，通過(guò)與親和配基或目標(biāo)產(chǎn)物的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，洗脫目標(biāo)產(chǎn)物。 親和層析示意圖 圖 713 親和色譜分離示意圖 親和層析的操作 ? 親和層析包括進(jìn)料吸附、清洗、洗脫和介質(zhì)再生幾個(gè)步驟 。吸附劑經(jīng)再生后可反復(fù)使用。使用梯度洗脫時(shí)，離子強(qiáng)度逐漸增加。 第三節(jié) 離子交換層析 ? 離子交換層析的原理 離子交換層析 (Ion exchange chromatography， IEC)是利用離子交換劑為固定相，根據(jù)荷電溶質(zhì)與離子交換劑之間靜電相互作用力的不同而發(fā)生差速遷移，從而實(shí)現(xiàn)溶質(zhì)分離的洗脫層析法 。 生物物質(zhì)的分離純化需要多步操作 ， 上一步操作所用緩沖液有時(shí)不適合于下一步單元操作的有效實(shí)施 (例如 ， 某些鹽離子抑制蛋白質(zhì)在親和吸咐劑上的吸附 )， 必須進(jìn)行緩沖液的交換 。 二 、 凝膠層析的應(yīng)用及特點(diǎn) 1． 分離純化 GFC可用于相對(duì)分子質(zhì)量從幾百到 l06數(shù)量級(jí)的物質(zhì)的分離純化 ， 是蛋白質(zhì) 、 肽 、 脂質(zhì)
教學(xué)課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1