【正文】 RPC中溶質(zhì)也通過疏水性相互作用分配于固定相表面，但是 RPC固定相表面完全被非極性基團所覆蓋，表現(xiàn)強烈的疏水性。高價陰離子的鹽析作用較大。 洗脫 ? IEC操作很少采用恒定洗脫法，而多采用流動相離子強度線性增大的線性梯度洗脫法(1inear gradient e1ution)或離子強度階躍增大的逐次洗脫法 (step wise elution)。例如，青霉素的致敏作用 — 般認(rèn)為是產(chǎn)品中存在的一些高分子雜質(zhì)所致，如青霉素聚合物和青霉素降解產(chǎn)物青霉烯酸與蛋白質(zhì)相結(jié)合形成的青毒噻唑蛋白，它們都是具有強烈致敏性的抗原。 3．凝膠過濾介質(zhì) 凝膠過濾層析常用于蛋白質(zhì)等生物大分子的分級分離和除鹽 。 （ 2） 裝柱 裝柱前 ， 柱的底部要先放些玻璃棉 、 玻璃細(xì)孔板等可拆卸的支持物 ， 以支持固定相 。 二 、 層析分類 1． 流動相與固定相 層析法根據(jù)流動相的相態(tài)分氣相層析法、液相層析法和超臨界流體層析法。色譜峰的區(qū)域?qū)挾韧ǔＳ腥N表示方法： ①標(biāo)準(zhǔn)偏差 σ 即 。但實際上，流出曲線并非完全對稱，不正常的色譜峰有拖尾峰和前伸峰，如圖 74(b)、 (c)所示。由于各組分在固定相中的分配系數(shù)（或溶解、吸附、交換、滲透或親和能力）的差異，使各組分隨流動相移動的速率不同，分配系數(shù)大的溶質(zhì)在固定相上存在的幾率大，隨流動相移動的速度小。 平衡系數(shù) K主要與下列因素有關(guān)： ① 被分離物質(zhì)本身的性質(zhì)； ② 固定相和流動相的性質(zhì)； ③ 色譜柱的操作溫度 。 ③死時間 t0 不被固定相滯留的組分（氣相色譜中如空氣、甲烷等），從開始進樣到柱出口處出現(xiàn)濃度最大值時所需的時間稱為死時間，其值等于流動相流經(jīng)色譜柱的時間，如圖 73所示。 標(biāo)準(zhǔn)偏差、峰寬與半高峰寬的單位由色譜峰橫坐標(biāo)單位而定，可以是時間、體積或距離等。 3． 壓力 在以固體 (包括以固體為載體的液體薄層 )為固定相的液相層析中 ， 根據(jù)操作壓力的不同 ， 又分為低壓 (壓力一般小于)、 中壓 (壓力為 ～ 40MPa)和高壓 (壓力為 ～40MPa)液相層析法 。當(dāng)樣品液面恰與凝膠床表面平時，加入數(shù)毫升洗脫劑沖洗管壁。 原料中環(huán)氧氯丙烷用量越大 ， 交聯(lián)度越高 ， 凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越緊密 ， 吸水量越小 。 生物物質(zhì)的分離純化需要多步操作 ， 上一步操作所用緩沖液有時不適合于下一步單元操作的有效實施 (例如 ， 某些鹽離子抑制蛋白質(zhì)在親和吸咐劑上的吸附 )， 必須進行緩沖液的交換 。使用梯度洗脫時，離子強度逐漸增加。 親和層析示意圖 圖 713 親和色譜分離示意圖 親和層析的操作 ? 親和層析包括進料吸附、清洗、洗脫和介質(zhì)再生幾個步驟 。 ? 應(yīng)用 ? RPC主要用于相對分子質(zhì)量低于 5000，特別是1000以下的非極性小分子物質(zhì)的分析和純化，也可用于蛋白質(zhì)等生物大分子的分析和純化。 ? 目標(biāo)產(chǎn)物的洗脫方法有特異性洗脫和非特異性洗脫。 疏水性相互作用層析的操作 ? 基本操作同其它層析柱 ? 為了有效地洗脫吸附劑上的生物大分子，可以用下列的一種或幾種方法：①改換一種具有較低鹽析效應(yīng)的離子；②降低離子強度；③減弱洗脫劑的極性，也可加入乙二醇；④用含有表面活性劑的洗脫劑；⑤提高洗脫劑的 pH。 凝膠層析的特點 ①溶質(zhì)與介質(zhì)不發(fā)生任何形式的相互作用。除 GFC外，瓊脂糖凝膠經(jīng)化學(xué)修飾后主要用于離子交換層析、疏水性相互作用層析及親和層析的載體。 （ 4）凝膠的再生和保養(yǎng) 理論上因為凝膠本身不與溶質(zhì)發(fā)生作用，所以層析分離后無需再生處理，但實際操作時凝膠層常有一定的污染，必須作適當(dāng)?shù)奶幚怼? 第二節(jié) 凝膠過濾層析 圖 76 GFC的分離原理及洗脫曲線 GFC操作中溶質(zhì)的分配系數(shù) M只是相對分子質(zhì)量、分子形狀和凝膠結(jié)構(gòu) (孔徑分布 )的函數(shù)，與所用洗脫液的 pH值和離子強度等物性無關(guān)，即在一般的層析操作條件下、相對分子質(zhì)量一定的溶質(zhì)的分配系數(shù)為常數(shù)。 圖 75 分離度影響示意圖 （ 8）柱效 柱效是表達色譜柱性能的一個重要參數(shù)，可用 塔板數(shù) N和塔板高度 H表示，其計算式為： 1 / 25 .5 4 ( )RtN W?LHN? 假設(shè)色譜柱的內(nèi)徑和柱內(nèi)的填料是均勻一致的，混合液流經(jīng)一小段色譜柱后，各組分在兩相間達平衡。 ⑦相對保留值 r2,1 在相同的操作條件下，待測組分與參比組分的校正保留值之比，稱為相 對保留值，又稱為選擇因子。 （ 1）基線 在操作條件下，色譜柱出口處沒有組分流出，僅有純流動相流過檢測器，此時的流出曲線稱為基線，如圖 73中 OC曲線。第七章 層析技術(shù) 第一節(jié) 層析的基本原理及分類 第二節(jié) 凝膠過濾層析 第三節(jié) 離子交換層析 第四節(jié) 疏水性相互作用層析 第五節(jié) 親和層析 第六節(jié) 反相層析 學(xué)習(xí)目標(biāo) ? 了解層析方法的分類及各種層析方法的應(yīng)用特點； ? 掌握層析的基本原理及各種層析方法的原理及操作； ? 能利用各種層析技術(shù)對生物物質(zhì)進行分離純化。色譜圖的縱坐標(biāo)為檢測器