【正文】 的響應(yīng)信號(hào)；橫坐標(biāo)為時(shí)間 t， 也可用流動(dòng)相體積 V或距離 L表示。保留體積 VR中扣除死體積 V0后，即校正保留體積VR′ ， 將更合理地反映被測(cè)組分的保留特點(diǎn)。當(dāng) R1時(shí)，兩峰有部分重疊；當(dāng) R = 1時(shí)，兩峰有 98%的分離；當(dāng) R = ，分離程度可達(dá) %；一般用 R = 離的標(biāo)志。 相對(duì)分子質(zhì)量大于溶質(zhì) l和小于溶質(zhì) 4的溶質(zhì)的洗脫體積分別與溶質(zhì) 1和溶質(zhì) 4相同 。多糖類物質(zhì)的洗脫以水為最佳，有時(shí)為了使樣品溶液解度增加而使用含鹽洗脫劑。Sepharose CL是利用環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)制備的瓊脂糖凝膠，機(jī)械強(qiáng)度較普通 Sepharose高。 不過 ， GFC僅對(duì)球形分子的測(cè)量精度較高 ， 對(duì)分子形狀為棒狀的物質(zhì) ， 測(cè)量值將小于實(shí)際值 。疏水性配基與親水性固定相粒子之間的偶聯(lián)主要利用氨基或醚鍵結(jié)合。 ? 清洗操作目的是洗去介質(zhì)顆粒內(nèi)部和顆粒間空隙中的雜質(zhì)，一般使用與吸附時(shí)相同的緩沖液 。由于反相介質(zhì)表面為強(qiáng)烈疏水性，并且流動(dòng)相為低極性有機(jī)溶劑，生物活性大分子在 RPC分離過程中容易變性失活。 ? 為了減小吸附操作中的非特異性吸附，所用的緩沖液的離子強(qiáng)度要適當(dāng)，緩沖液的 pH應(yīng)使配基與目標(biāo)產(chǎn)物及雜質(zhì)的靜電作用較小。陽離子交換劑的洗脫 pH由低到高，陰離子交換劑的洗脫 pH由高到低。 若將緩沖液 A換成緩沖液 B， 可先用 B液沖洗 GFC柱 ， 上樣后用 B液洗脫 ， 即可完成緩沖液的交換 。 Sephadex凝膠按交聯(lián)度大小 ， 分 Gl0～ G200共八種型號(hào) 。這一步關(guān)鍵是既 要使樣品恰好全部滲入凝膠床，又不致使凝膠表面干燥而發(fā)生裂縫。 高壓液相層析法中層析介質(zhì) （ 固定相 ）微細(xì) ， 分離精度高 、 速度快 ， 主要用于成分分析 。在理想的色譜中，組分的譜帶應(yīng)是很窄的，若譜帶較寬，將直接導(dǎo)致分離效果下降。 ④ 死體積 V0 不被固定相滯留的組分，從進(jìn)樣到出現(xiàn)最大峰值所需流動(dòng)相的體積，稱為死體積。一般情況下 ， 溫度與平衡系數(shù)成反比 ， 各組分平衡系數(shù) K的差異程度決定了色譜分離的效果 ， K值差異越大 ， 色譜分離效果越理想 。 固定相填充于柱中，在柱的頂端(入口 )加入一定量的料液后，連續(xù)輸入流動(dòng)相，料液中的溶質(zhì)在流動(dòng)相和固定相之間發(fā)生擴(kuò)散傳質(zhì)，產(chǎn)生分配平衡。 （ 3）峰形 正常的色譜流出曲線為對(duì)稱于 峰尖的正態(tài)分布曲線，如圖 74(a)所示。 （ 6）區(qū)域?qū)挾? 色譜峰的區(qū)域?qū)挾瓤珊饬恐?，并且可與峰高相乘來計(jì)算峰面積，如圖 73所示。 （ 9）色譜流出曲線的意義 色譜峰數(shù)等于樣品中單組分的最少個(gè)數(shù)；色譜保留值是定性分析的依據(jù)；色譜峰高或面積是定量分析的依據(jù)；色譜保留值或區(qū)域?qū)挾仁巧V柱分離效能的評(píng)價(jià)指標(biāo)；色譜峰間距是固定相或流動(dòng)相選擇是否合適的判定依據(jù)。洗脫劑應(yīng)具有一定的離子強(qiáng)度（約為 ）。 常用的抑菌劑有：疊氮鈉 （ %） 、 三氯丁醇 （ %～ %） 、 乙基汞硫代水揚(yáng)酸鈉 (%～ %)、 苯基汞代鹽 （ 包括 、 苯基汞代乙酸鹽 、 硝酸鹽 、 硼酸鹽 ， %～ %） 。 此外， GFC還可用于醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中無熱原水的制備以及低分子生物制劑中抗原性雜質(zhì)的除去。進(jìn)行層析時(shí)，先將樹脂用展開劑處理，使樹脂層析劑轉(zhuǎn)變成展開劑離子的型式；然后將溶解在少量溶劑（通常為展開劑）中的試樣加到層析柱的上部，再通入展開劑展開，流出液分步收集，測(cè)定其含量。除離子強(qiáng)度外，離子的種類亦影響蛋白質(zhì)的疏水性吸附。 第六節(jié) 反相層析 ? 反相層析 (Reversed— phase chromatography，RPC)是利用非極性的反相介質(zhì)為固定相，極性有機(jī)溶劑的水溶液為流動(dòng)相，根據(jù)溶質(zhì)極性 (疏水性 )的差別進(jìn)行溶質(zhì)分離純化的洗脫層析法。因此，必須采用極性有機(jī)溶劑（如甲醇、乙氰等）或其水溶液進(jìn)行溶質(zhì)的洗脫分離。疏水性吸附與鹽析沉淀一樣，在高價(jià)陰離子的存在下作用力較高。 在線性梯度洗脫和逐次洗脫過程中， IEC柱內(nèi)溶質(zhì)區(qū)帶后部的離子強(qiáng)度高于前部，因此區(qū)帶后部的移動(dòng)速度高于前部，溶質(zhì)在洗脫過程中得到濃縮。利用Sephadex G25凝膠柱處理青霉素溶液可除去這類高分子雜質(zhì)。 因此 ， 良好凝膠過濾介質(zhì)應(yīng)滿足以下要求： ① 親水性高 ， 表面惰性 ， 即介質(zhì)與溶質(zhì)之間不發(fā)生任何化學(xué)或物理相互作用； ② 穩(wěn)定性強(qiáng) ， 在較寬的 pH和離子強(qiáng)度范圍以及化學(xué)試劑中保持穩(wěn)定 ， 使用壽命長(zhǎng)； ③ 具有一定的孔徑分布范圍； ④ 機(jī)械強(qiáng)度高 ， 允許較高的操作壓力 (流速 )。 凝膠要懸浮在洗脫劑中 ， 在攪拌下緩慢加入柱中 ， 使凝膠自然沉積 ， 直到所需高度為止 。而固定相有 固體、液體和以固體為載體的液體薄層。 ②半高峰寬 W1/2 即 1/2峰高處的峰寬。 (a) (b) (c) 圖 74 峰形示意圖 （ 4）保留值 表示混合物中各組分在色譜柱中停留時(shí)間或?qū)⒔M分帶出色譜柱所需流動(dòng)相體積的數(shù)值，稱為保留值。因此當(dāng)流動(dòng)相 移動(dòng)一定柱長(zhǎng)后，使各 組分在層析柱內(nèi)分層，從而達(dá)到各組分分離的目的。 其表達(dá)通式可寫為： （