【正文】 、 抗生素 、 糖類(lèi) 、 核酸以及病毒 (50 nm ～ 400nm)的分離與分析中頻繁使用的液相層析法 。 原料中環(huán)氧氯丙烷用量越大 ， 交聯(lián)度越高 ， 凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越緊密 ， 吸水量越小 。 為了抑制微生物在凝膠層內(nèi)生長(zhǎng) ， 在凝膠床保存之前必須完全除去磷酸根離子和所有底物 ， 將柱真空保存或低溫保存 ， 但溫度不可過(guò)低 ， 離子強(qiáng)度要高一些 ， 以防凍結(jié) 。當(dāng)樣品液面恰與凝膠床表面平時(shí)，加入數(shù)毫升洗脫劑沖洗管壁。 2． 凝膠層析的操作 （ 1）凝膠的處理 葡聚糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠上以干品出售的，所以在使用前必須溶脹。 3． 壓力 在以固體 (包括以固體為載體的液體薄層 )為固定相的液相層析中 ， 根據(jù)操作壓力的不同 ， 又分為低壓 (壓力一般小于)、 中壓 (壓力為 ～ 40MPa)和高壓 (壓力為 ～40MPa)液相層析法 。理論塔板數(shù)的多少可反映色譜柱分離性能的優(yōu)劣。 標(biāo)準(zhǔn)偏差、峰寬與半高峰寬的單位由色譜峰橫坐標(biāo)單位而定，可以是時(shí)間、體積或距離等。 相對(duì)保留值 r2,1可以消除某些操作條件對(duì)保留值的影響，只要柱溫、固定相和流動(dòng)相的性質(zhì)保持不變，即使填充情況、柱長(zhǎng)、柱徑及流動(dòng)相流速有所變化，相對(duì)保留值仍保持不變。 ③死時(shí)間 t0 不被固定相滯留的組分（氣相色譜中如空氣、甲烷等），從開(kāi)始進(jìn)樣到柱出口處出現(xiàn)濃度最大值時(shí)所需的時(shí)間稱(chēng)為死時(shí)間，其值等于流動(dòng)相流經(jīng)色譜柱的時(shí)間，如圖 73所示?；€(xiàn)反映了操作條件下，檢測(cè)器系統(tǒng)噪聲隨時(shí)間變化的波動(dòng)情況，穩(wěn)定的基線(xiàn)應(yīng)是一條平行于橫坐標(biāo)的直線(xiàn)。 平衡系數(shù) K主要與下列因素有關(guān)： ① 被分離物質(zhì)本身的性質(zhì)； ② 固定相和流動(dòng)相的性質(zhì)； ③ 色譜柱的操作溫度 。典型的柱層析分離設(shè)備示于圖 71中。由于各組分在固定相中的分配系數(shù)（或溶解、吸附、交換、滲透或親和能力）的差異，使各組分隨流動(dòng)相移動(dòng)的速率不同，分配系數(shù)大的溶質(zhì)在固定相上存在的幾率大，隨流動(dòng)相移動(dòng)的速度小。 設(shè)體積為 V的流動(dòng)相流過(guò)色譜系統(tǒng)，流速很慢，可以認(rèn)為溶質(zhì)在兩相間平衡，則： msVVA K A?? ?溶 質(zhì) 移 動(dòng) 距 離 能 進(jìn) 行 分 配 的 有 效 截 面 積流動(dòng)相移動(dòng)距離 = V/Am mfmsARA KA? ? 由阻滯因數(shù)的定義式可得： 因此，當(dāng) Am、 As一定時(shí)（與裝柱時(shí)的緊密程度有關(guān)），一定的平衡系數(shù) K有相應(yīng)的 Rf值。但實(shí)際上，流出曲線(xiàn)并非完全對(duì)稱(chēng)，不正常的色譜峰有拖尾峰和前伸峰，如圖 74(b)、 (c)所示。 ⑤ 校正保留時(shí)間 tR′ 扣除死時(shí)間后的保留時(shí)間稱(chēng)為校正保留時(shí)間（或調(diào)整保留時(shí)間），如圖 73所示；校正保留時(shí)間可理解為組分在固定相中實(shí)際滯留的時(shí)間。色譜峰的區(qū)域?qū)挾韧ǔＳ腥N表示方法： ①標(biāo)準(zhǔn)偏差 σ 即 。 分離度 R綜合考慮了保留值的差值與峰寬兩方面的因素對(duì)柱效率的影響，可衡量色譜柱的總分離效能。 二 、 層析分類(lèi) 1． 流動(dòng)相與固定相 層析法根據(jù)流動(dòng)相的相態(tài)分氣相層析法、液相層析法和超臨界流體層析法。 第二節(jié) 凝膠過(guò)濾層析 一 、 原理與操作 1． 凝膠層析的原理 凝膠過(guò)濾層析 (Gel filtration chromatography， GFC)又稱(chēng)體積排阻層析 、 分子篩層析 ， 是利用凝膠粒子 (通常稱(chēng)為凝膠過(guò)濾介質(zhì) )為固定相 ， 根據(jù)料液中溶質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的差別進(jìn)行分離的液相層析法 。 （ 2） 裝柱 裝柱前 ， 柱的底部要先放些玻璃棉 、 玻璃細(xì)孔板等可拆卸的支持物 ， 以支持固定相 。 非水溶性物質(zhì)的洗脫采用有機(jī)溶劑（如苯和丙酮），水溶性物質(zhì)的洗脫一般采用水或具有不同離子強(qiáng)度和 pH的緩沖液。 3．凝膠過(guò)濾介質(zhì) 凝膠過(guò)濾層析常用于蛋白質(zhì)等生物大分子的分級(jí)分離和除鹽 。 圖 77交聯(lián)葡聚糖網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) 圖 78瓊脂糖凝膠結(jié)構(gòu) 瓊脂糖凝膠是另一種較常使用的凝膠過(guò)濾介質(zhì)，其骨架結(jié)構(gòu)如圖78所示。例如，青霉素的致敏作用 — 般認(rèn)為是產(chǎn)品中存在的一些高分子雜質(zhì)所致，如青霉素聚合物和青霉素降解產(chǎn)物青霉烯酸與蛋白質(zhì)相結(jié)合形成的青毒噻唑蛋白，它們都是具有強(qiáng)烈致敏性的抗原。 首先用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)如細(xì)胞色素C(12500， 指分子量 ， 下同 )、 肌紅蛋白 (16900)、 胰凝乳蛋白酶 (23200)、 卵白蛋白 (45000)和血紅蛋白 (64500)等分別進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析實(shí)驗(yàn) ， 確定分配系數(shù)與相對(duì)分子質(zhì)量的關(guān)系式 。 洗脫 ? IEC操作很少采用恒定洗脫法，而多采用流動(dòng)相離子強(qiáng)度線(xiàn)性增大的線(xiàn)性梯度洗脫法(1inear gradient e1ution)或離子強(qiáng)度階躍增大的逐次洗脫法 (step wise elution)。 疏水性吸附劑 ? 各種凝膠過(guò)濾介質(zhì)經(jīng)偶聯(lián)疏水性配基后均可用作疏水性吸附劑。高價(jià)陰離子的鹽析作用較大。提高流速雖可加快分離速度，但會(huì)降低柱效。 RPC中溶質(zhì)也通過(guò)疏水性相互作用分配于固定相表面，但是 RPC固定相表面完全被非極性基團(tuán)所覆蓋，表現(xiàn)強(qiáng)烈的疏水性。