層析技術(shù)的應(yīng)用-閱讀頁
2025-07-28 22:36本頁面
【正文】 。這種高壓泵應(yīng)滿足以下條件：①流量恒定，無脈動(dòng)，并有較大的調(diào)節(jié)范圍。③有較高的輸出壓力，一般要達(dá)到15～300kg/c，也有的高達(dá)800kg/c。梯度洗脫裝置必須具備兩臺(tái)高壓泵，一臺(tái)輸送強(qiáng)溶劑，一臺(tái)輸送弱溶劑，兩泵運(yùn)轉(zhuǎn)速度用電腦控制，并可按一定的要求改變流動(dòng)相的組成，以改善分離效果。HPLC中所用的檢測(cè)器最多應(yīng)用的是紫外吸收檢測(cè)，靈敏度可達(dá)ng水平?！ 、睭PLC的類型與應(yīng)用 ⑴液固吸附層析：固定相是具有吸附活性的吸附劑，常用的有硅膠、氧化鋁、高分子有機(jī)酸或聚酰胺凝膠等。流動(dòng)相中底劑與洗脫劑成分的組合和選擇，直接影響色譜的分離情況，一般底劑為極性較低的溶劑，如正已烷、環(huán)已烷、戊烷、石油醚等，洗脫劑則根據(jù)試樣性質(zhì)選用針對(duì)性溶劑，如醚、酯、酮、醇和酸等?！ 、埔阂悍峙鋵游觯汗潭ㄏ酁閱误w固定液構(gòu)成。這種以化學(xué)鍵合相為固定相的液液層析稱為化學(xué)鍵合相層析?；瘜W(xué)鍵合層析分：①極性鍵合相層析：固定相為極性基團(tuán)，氰基、氨基及雙羥基三種。極性小的組份先出峰，極性大的后出峰，這稱為正相層析法，適用于分離極性化合物。最常用的是不同比例的水和甲醇配制的混合溶劑，水不僅起洗脫作用還可掩蓋載體表面的硅羥基，防止因吸附而至的拖尾現(xiàn)象。本法適用于小分子物質(zhì)的分離，如肽、核苷酸、糖類、氨基酸的衍生物等。流動(dòng)相為極性較低的有機(jī)溶劑。本法優(yōu)點(diǎn)是流動(dòng)相選擇余地大，缺點(diǎn)是固定相易流失。本法優(yōu)點(diǎn)是固定相不存在流失問題、流動(dòng)相含水或緩沖液更適用于電離性化合物的分離。在離子交換HPLC中，固定相多用離子性鍵合相，故本法又稱離子性鍵合相層析。 ?。ㄋ模┯H和層析法 親和層析是利用待分離物質(zhì)和它的特異性配體間具有特異的親和力，從而達(dá)到分離目的的一類特殊層析技術(shù)?？捎H和的一對(duì)分子中的一方以共價(jià)鍵形式與不溶性載體相連作為固定相吸附劑，當(dāng)含有混合組份的樣品通過此固定相時(shí)，只有和固定相分子有特異親和力的物質(zhì)，才能被固定相吸附結(jié)合，其它沒有親和力的無關(guān)組份就隨流動(dòng)相流出，然后改變流動(dòng)組成份，將結(jié)合的親和物洗脫下來?！ ∮H和層析純化過程簡(jiǎn)單、迅速，且分離效率高。但本法必須針對(duì)某一分離對(duì)象，制備專一的配基和尋求層析的穩(wěn)定條件，因此親和層析的應(yīng)用范圍受到了一定的限制?！ ?yīng)用實(shí)例：2胰凝乳蛋白酶的提純 ?、庇H和吸附劑（Σ氨基N乙酰Ｄ色氨酸）的制備取一定體積的Sepharose4B加100mgCNBr。20℃左右，812分鐘完成反應(yīng)。（）溶液混合，接著迅速加入α胰蛋白酶抑制劑（Σ氨基N乙酰色氨酸甲酯）。4℃緩慢攪拌約24小時(shí)，而后再用水和緩沖液反復(fù)地洗至沒有游離的抑制劑為止。 ?、卜蛛x 親和吸附劑裝柱后用50mmol/L TrisHCl（）緩沖液平衡（室溫）。流速為3060ml/小時(shí)，直至280nm無光吸收時(shí)停止洗滌，（）洗脫。它的原理是根據(jù)各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同進(jìn)行分離的過程，因此本方法具有高分辨、高度濃縮和高度專一等特點(diǎn)?！ 【劢箤游鏊媚z主要有兩種：MONOP和多元緩沖液交換劑（PBE）。多元緩沖液交換劑是一種交換凝膠，適用作普通聚焦層析的介質(zhì)。表168 聚焦層析技術(shù)數(shù)據(jù)凝膠名稱pH范圍洗脫MONOP118Pharmalyte PBE118 Pharmalyte MONOP96多元緩沖液96PBE 9474多元緩沖液74PBE9474多元緩沖液74 NONOP可制成兩種高效液相柱：MONOp HR5/5(1ml)，和MONOp HR5/20(5ml)。HR5/5分辨率為pI，HR5/20pI。在聚焦層析時(shí)，通過使用不同的洗脫液，可使交換容量發(fā)生改變，并且使pH達(dá)到更廣的范
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