11酶工程酶的蛋白質(zhì)工程-資料下載頁(yè)
2025-08-16 02:05本頁(yè)面
【正文】 ─────────── 白細(xì)胞介素 2 Cys→ Ser 提高產(chǎn)物活性 不成功 (產(chǎn) 物穩(wěn)定性 ↓ ) ─────────────────────────── ─────────────────────────── ─────────────────────────── 二氫葉酸 Asp→ Asn 驗(yàn)證酶的活性 成功 中心還原酶 ─────────────────────────── ─────────────────────────── ─────────────────────────── 二 . 蛋白質(zhì)工程的在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用 1. 關(guān)于分子導(dǎo)向多肽藥物的設(shè)計(jì)與研制 : 人們希望利用特異性結(jié)合的特點(diǎn) ,將單克隆抗體作為定向載體 ,但是有關(guān)單克隆抗體與藥物、核素、毒素的耦合物試驗(yàn)結(jié)果并不理想。對(duì)此人們應(yīng)用蛋白質(zhì)工程進(jìn)行 “ 重新設(shè)計(jì) ” ,即利用DNA重組技術(shù)的手段 , 將不同功能的基因區(qū)段進(jìn)行重新拼接 ,進(jìn)行克隆并表達(dá)出雜合蛋白質(zhì) ,初步結(jié)果很好。 α 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 (TGFα) 與綠膿桿菌毒素的Ⅱ 與 Ⅲ 區(qū)段的基因 (PE40)拼接形成的雜合蛋白能夠明顯地延長(zhǎng)荷瘤裸鼠 (腫瘤細(xì)胞表面有 TGF的受體 )的生存期 ,但該雜合毒素卻不殺死不帶此受體的細(xì)胞。由此可見(jiàn)通過(guò)蛋白質(zhì)工程可以制備特異性很強(qiáng)的 “ 生物導(dǎo)彈 ” 。 抗體工程的設(shè)計(jì)與研制 : 蛋白質(zhì)工程中進(jìn)展最快又與醫(yī)學(xué)密切相關(guān)的是 “ 抗體工程 ” 。目前單克隆抗體 (簡(jiǎn)稱單抗 )用于臨床疾病治療問(wèn)題之一是由于其絕大多數(shù)來(lái)源于小鼠 (小鼠免疫球蛋白 )。 對(duì)于人體而言它是一種異體蛋白 , 會(huì)引起人體產(chǎn)生人抗鼠抗體 。 若再度使用小鼠單抗 , 不僅會(huì)中和單抗使之失效 ,還產(chǎn)生有害的過(guò)敏反應(yīng) 。 對(duì)此人們應(yīng)用 DNA重組技術(shù)對(duì)抗體進(jìn)行改造 ,出現(xiàn)了抗體工程 。 它包括嵌合抗體 、 重構(gòu)抗體 、 單鏈抗原結(jié)合區(qū) 、 單功能域抗體及全套抗體的研究 ,其主要目的是使鼠源性抗體 “ 人源化 ” 。 嵌合抗體 : 是應(yīng)用 DNA 重組技術(shù)將鼠源單抗的可變區(qū) (V區(qū) )基因與人免疫球蛋白 (Ig)的恒定區(qū) (C區(qū) )基因相連接 ,構(gòu)建成嵌合基因 ,導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)行表達(dá) ,制成嵌合抗體。目前國(guó)內(nèi)外已制備了數(shù)十種嵌合抗體。 由于該抗體已 “ 人源化 ” , 其免疫原性已大為降低。在初期臨床試驗(yàn)中 ,人源化嵌合抗體能夠解決一些問(wèn)題 ,且半衰期可以延長(zhǎng)許多倍。 蛋白質(zhì)工程存在的問(wèn)題 蛋白質(zhì)工程集中了當(dāng)代分子生物學(xué)一些最新成就 , 并將核酸研究與蛋白質(zhì)研究結(jié)合起來(lái) ,同時(shí)也將基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究結(jié)合起來(lái) 。 但它的發(fā)展受以下幾個(gè)因素制約 : :以分子定向改造為目標(biāo)的蛋白質(zhì)工程須借助于精確的三維結(jié)構(gòu)信息 ,而目前主要靠 X射線單晶體結(jié)構(gòu)分析 ,受到單晶培養(yǎng)的限制 。 目前正在尋求通過(guò)電子衍射三維分析 、 二維核磁共振等手段來(lái)克服上述限制 。 2. 基因高效表達(dá)以及有效的下游技術(shù) 是蛋白質(zhì)工程的又一限制因素。人們正試圖尋找高效表達(dá)載體、分泌性系統(tǒng)以及各種高效批量分離技術(shù)來(lái)克服這一限制。 ATL 的氨基酸序列與模擬三維結(jié)構(gòu)分析 1) 理性設(shè)計(jì)確定 ATL 突變位點(diǎn) 2) 重組菌株的誘導(dǎo)表達(dá)及分離純化 ? 畢赤酵母 Pichia pastoris GS115 用于目的蛋白外源表達(dá)表達(dá)載體 pPIC9K。 ? 土曲霉 A. terreus 脂肪酶基因 ATL序列 (GenBank Accession No. )根 據(jù)畢赤酵母的密碼子偏好性優(yōu)化后，由南京金斯 瑞公司合成。 ? 1%的甲醇誘導(dǎo)表達(dá)， NiNTA 鎳柱親和層析 3）突變酶和野生型酶的酶學(xué)性質(zhì) 最適 pH 及 pH 穩(wěn)定性 最適溫度及溫度穩(wěn)定性 底物特異性 酶促反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)常數(shù) 綜合上述兩種突變酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，選定的突變位點(diǎn)雖然使得脂肪酶對(duì)底物的親和能力降低，但顯著提高了酶的催化速度，從而提高了脂肪酶的催化活性 。 4）突變酶的結(jié)構(gòu)分析 突變酶 ATLLid 的底物結(jié)合口袋與野生型相比，位于對(duì)硝基苯所在方向的口袋區(qū)域顯著增大，與野生型相比空間位阻減少 (黃色箭頭所示 )，使對(duì)硝基苯酚酯類底物更好地進(jìn)入口袋并與活性中心結(jié)合，從而提高ATLLid 對(duì)該類底物的偏好性。 結(jié)論 綜上所述，本研究采用理性設(shè)計(jì)的方法，對(duì)來(lái)自 A. terreus 的脂肪酶 ATL 的蓋子區(qū)域和底物結(jié)合口袋域中的位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，得到了對(duì)對(duì)硝基苯酚酯類底物催化活性顯著提高的兩種突變酶 ATLLid 和 ATLV218W。利用同源建模模擬及分子對(duì)接等手段分析得出， ATLLid 蓋子區(qū)域的突變可使蓋子柔性增強(qiáng)、疏水性提高和底物結(jié)合口袋變大，使得底物更易進(jìn)入催化活性中心，提高對(duì)長(zhǎng)鏈底物的催化活力。 ATLV218W 底物結(jié)合口袋域的突變則影響了催化三聯(lián)體中的 Asp208 的空間位置，進(jìn)而影響酶的催化活性。
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