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11酶工程酶的蛋白質(zhì)工程-wenkub.com

2024-08-23 02:05 本頁(yè)面
   

【正文】 ATLV218W 底物結(jié)合口袋域的突變則影響了催化三聯(lián)體中的 Asp208 的空間位置,進(jìn)而影響酶的催化活性。 ? 1%的甲醇誘導(dǎo)表達(dá), NiNTA 鎳柱親和層析 3)突變酶和野生型酶的酶學(xué)性質(zhì) 最適 pH 及 pH 穩(wěn)定性 最適溫度及溫度穩(wěn)定性 底物特異性 酶促反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)常數(shù) 綜合上述兩種突變酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn),選定的突變位點(diǎn)雖然使得脂肪酶對(duì)底物的親和能力降低,但顯著提高了酶的催化速度,從而提高了脂肪酶的催化活性 。 2. 基因高效表達(dá)以及有效的下游技術(shù) 是蛋白質(zhì)工程的又一限制因素。在初期臨床試驗(yàn)中 ,人源化嵌合抗體能夠解決一些問(wèn)題 ,且半衰期可以延長(zhǎng)許多倍。 它包括嵌合抗體 、 重構(gòu)抗體 、 單鏈抗原結(jié)合區(qū) 、 單功能域抗體及全套抗體的研究 ,其主要目的是使鼠源性抗體 “ 人源化 ” 。目前單克隆抗體 (簡(jiǎn)稱單抗 )用于臨床疾病治療問(wèn)題之一是由于其絕大多數(shù)來(lái)源于小鼠 (小鼠免疫球蛋白 )。對(duì)此人們應(yīng)用蛋白質(zhì)工程進(jìn)行 “ 重新設(shè)計(jì) ” ,即利用DNA重組技術(shù)的手段 , 將不同功能的基因區(qū)段進(jìn)行重新拼接 ,進(jìn)行克隆并表達(dá)出雜合蛋白質(zhì) ,初步結(jié)果很好。 研究表明該酶與其底物之間能形成 11對(duì)氫鍵 ,其中 8對(duì)氫鍵的形成來(lái)源于酶的氨基酸側(cè)鏈。 第三節(jié) 蛋白質(zhì)工程成果及應(yīng)用 一 . 蛋白質(zhì)工程的成果 在十幾年里 ,蛋白質(zhì)工程已取得鼓舞人心成果 。 b. 顯性標(biāo)記: 包括藥物抗性標(biāo)記,如潮霉素 B抗性、卡那霉素抗性和苯菌靈抗性等 c. 細(xì)菌的報(bào)告基因: 在絲狀真菌啟動(dòng)子帶動(dòng)下的表達(dá),也可作為選擇標(biāo)記,如 lacZ等。 牛溶菌酶前體經(jīng) P. pastoris正確修飾后分泌到培養(yǎng)基中,分泌的蛋白與天然溶菌酶活性相當(dāng),在10 L發(fā)酵罐發(fā)酵 200 h,產(chǎn)量達(dá) 2 g/L 。 乙醇氧化酶基因 aoxl的啟動(dòng)子是一個(gè)很強(qiáng)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子 , 甲醇誘導(dǎo)時(shí) , 酶產(chǎn)量可達(dá)總蛋白的 30% 。大腸桿菌表達(dá)體系能將 N端的甲硫氨酸除去,但不能將第二個(gè)氨基酸 (Ala)乙酰化 。 目標(biāo)酶 所需功能 方法 結(jié)果 實(shí)施菌種 卡那霉素核苷基轉(zhuǎn)移酶 熱穩(wěn)定性 定位誘變 +選擇 在 6050℃ 酶半衰期增加 200倍 耐熱脂肪芽孢桿菌 枯草桿菌蛋白酶 作用于有機(jī)溶劑 易錯(cuò) PCR+選擇 在 60%二甲基亞砜活力增強(qiáng) 170倍 枯草桿菌 β 內(nèi)酰胺酶 作用于新底物 DNA改組 +選擇 對(duì) cefotaxime的抗性增加 32022倍 大腸桿菌 對(duì)硝基苯酯酶 有機(jī)溶劑中的底物特異性和活性 易錯(cuò) PCR+重組 活力增加 60150倍 大腸桿菌 胸苷激酶 第五特異性 基因理療 交錯(cuò)延伸 +選擇 活力增加 43倍 大腸桿菌 β 半乳糖苷酶 底物特異性 DNA改組 +選擇 活力增加 66倍底物特異性增加 1000倍 大腸桿菌 砷酸脫毒途徑 砷酸抗性 DNA改組 +選擇 抗性增加 12倍 大腸桿菌 定向進(jìn)化的應(yīng)用 酶的半理性設(shè)計(jì): 應(yīng)用部分已知的酶結(jié)構(gòu)或酶功能信息,或者通過(guò)隨機(jī)突變探測(cè)改變所需性質(zhì)的關(guān)鍵點(diǎn),隨后選定一些位點(diǎn)進(jìn)行常規(guī)隨機(jī)突變或飽和突變,提高對(duì)目標(biāo)酶的改造。 ?隨著生物催化在精細(xì)化工和醫(yī)藥行業(yè)的廣泛應(yīng)用,對(duì)手性純化合物的大量需求使手性酶的篩選成了當(dāng)前的研究熱點(diǎn),同時(shí)產(chǎn)品價(jià)值的提高也將使得很多借助復(fù)雜儀器設(shè)備的高成本的檢測(cè)方法成為可能并將逐漸得到更多的應(yīng)用。 ? 使用比色計(jì)或熒光計(jì)檢測(cè)顯色或熒光底物, pH指示劑顯色反應(yīng)和熒光共振能量轉(zhuǎn)移還可以實(shí)現(xiàn)高通量實(shí)時(shí)檢測(cè)。 突變體分離 突變酶分子的高通量篩選策略 檢測(cè)培養(yǎng)基篩選法 ? 通常是在培養(yǎng)基中加入某種試劑或化學(xué)藥物,使培養(yǎng)后發(fā)生某種可以辨別的變化,如培養(yǎng)基的透明度的變化或菌落周圍顏色的變化,由此區(qū)別不同類型或生理特性不同的微生物。 ? 微孔板懸浮法 在含生色底物平板上培養(yǎng),挑取具有活性的克隆接種到 96孔板上檢測(cè)吸光度。 體外隨機(jī)引發(fā)重組 體外隨機(jī)引發(fā)重組 (random priming in vitro rebination, RPR)以 單鏈 DNA為模板,配合一套隨機(jī)序列引物,先產(chǎn)生大量互補(bǔ)于模板不同位點(diǎn)的短 DNA片段,由于堿基的錯(cuò)配和錯(cuò)誤引發(fā),這些短 DNA片段中也會(huì)有少量的點(diǎn)突變,在隨后的PCR反應(yīng)中,它們 互為引物 進(jìn)行合成,伴隨組合,再組裝成完整的基因長(zhǎng)度。 ?連續(xù)易錯(cuò) PCR (sequential error prone PCR)策略。 酶分子定向進(jìn)化技術(shù)的關(guān)鍵 ? 定向進(jìn)化是一個(gè)由構(gòu)建突變體庫(kù),突變體表達(dá),表達(dá)后篩選三個(gè)步驟組成的循環(huán)遞進(jìn)過(guò)程,需要: ? (1) 產(chǎn)生包含大量帶有微量有利突變的突變體的文庫(kù) 。 蛋白質(zhì)定向進(jìn)化概念的提出 人為地創(chuàng)造特殊的進(jìn)化條件,模擬自然進(jìn)化機(jī)制,在體外對(duì)基因進(jìn)行隨機(jī)突變,從一個(gè)或多個(gè)已經(jīng)存在的親本酶(天然的或者人為獲得的)出發(fā),經(jīng)過(guò)基因的突變和重組,構(gòu)建一個(gè)人工突變酶庫(kù),通過(guò)一定的
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