11酶工程酶的蛋白質(zhì)工程-文庫吧資料
2024-08-29 02:05本頁面
【正文】 ───────── 二氫葉酸 Asp→ Asn 驗(yàn)證酶的活性 成功 中心還原酶 ─────────────────────────── ─────────────────────────── ─────────────────────────── 二 . 蛋白質(zhì)工程的在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用 1. 關(guān)于分子導(dǎo)向多肽藥物的設(shè)計(jì)與研制 : 人們希望利用特異性結(jié)合的特點(diǎn) ,將單克隆抗體作為定向載體 ,但是有關(guān)單克隆抗體與藥物、核素、毒素的耦合物試驗(yàn)結(jié)果并不理想。 1989年 ,Eersht等人應(yīng)用蛋白質(zhì)工程技術(shù)對這 8個側(cè)鏈殘基進(jìn)行系統(tǒng)突變以揭示側(cè)鏈在整個酶促反應(yīng)中的作用以及對決定酶與底物結(jié)合專一性方面的影響。末端形成酪氨酰 tRNA。 : 酪氨酰 tRNA合成酶是應(yīng)用蛋白質(zhì)工程技術(shù)研究得比較深入的酶之一 。但經(jīng)過減數(shù)分裂表現(xiàn)出高度的不穩(wěn)定。 表達(dá)水平： 與多種因素有關(guān)，包括選用的啟動子及其他調(diào)控序列的存在、目的基因整合位置、整入拷貝數(shù)和受體菌株等。優(yōu)點(diǎn)：載體質(zhì)粒可進(jìn)行同源整合，易于篩選； 缺點(diǎn)：大多數(shù)絲狀真菌難獲得營養(yǎng)缺陷型。 絲狀真菌 牛溶菌酶基因表達(dá)質(zhì)粒 三、絲狀真菌表達(dá)體系 得到發(fā)展主要理由是 ? 絲狀真菌的發(fā)酵技術(shù)成熟，有利于重組蛋白生產(chǎn) 的工業(yè)化； ? 絲狀真菌具有很強(qiáng)的分泌能力，有望提高重組蛋 白的生產(chǎn)效率； ? 新表達(dá)系統(tǒng)的建立可避開大腸桿菌生產(chǎn)重組蛋白 的專利限制； ? 米曲霉和黑曲霉等絲狀真菌被 FDA和世衛(wèi)組織認(rèn) 定安全 。 可用作為促進(jìn)反芻動物消化的飼料添加劑 。 畢赤酵母載體包括自主復(fù)制的游離載體和整合型載體 ， 由于沒有穩(wěn)定的附加體質(zhì)粒 ， 所以一般用整合型質(zhì)粒作為外源基因的表達(dá)載體 。 釀酒酵母表達(dá)質(zhì)粒 釀酒酵母誘導(dǎo)型表達(dá)載體的構(gòu)建 釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)的缺點(diǎn)： 嗜甲醇的酵母 (Pichia pastoris) 優(yōu)點(diǎn) ： 能在以甲醇為唯一碳源和能源的培養(yǎng)基中快速生長。 需用 真核系統(tǒng)表達(dá)！ 基因源：人的 Cu/ZnSOD cDNA基因 質(zhì)粒載體 ：釀酒 酵母 2 mm質(zhì)粒 啟動子：酵母甘油醛磷酸脫氫酶 (GAPD)啟動子 附加：轉(zhuǎn)錄終止信號、 poly(A)信號。 ① 避免目的蛋白在表達(dá)時被降解 ② 增加分泌性 ③ 提高溶解性 ? 重組酶的高效表達(dá) ? 一、細(xì)菌表達(dá)體系 ? 二、酵母系統(tǒng)中的表達(dá) ? 三、絲狀真菌中的表達(dá) 體系生產(chǎn)重組酶 常用宿主菌株的基因型 DH5： supE44, hsdR17, recA1, endA1, gyrA96, thi1, relA1 JM109: supE44, hsdR17, recA1, endA1, gyrA96, thi1, relA1 ?(lacproAB) / F’[traD36, proAB+, lacIq, lacZ ?M15 大腸桿菌表達(dá)載體必備元件： 二、 酵母表達(dá)系統(tǒng) 例 1： Cu／ Zn超氧化物歧化酶 (Cu/ZnSOD)是重要的醫(yī)用酶。 設(shè)計(jì)方法： 1. 基于結(jié)構(gòu)信息的對特定片段的定點(diǎn)隨機(jī)突變 2. 隨機(jī)突變與特定氨基酸的位點(diǎn)飽和突變結(jié)合 3. 計(jì)算機(jī)輔助的半理性設(shè)計(jì) 基因內(nèi)部剪接 在編碼基因的內(nèi)部插入或剪去特定的序列、結(jié)構(gòu)原件或結(jié)構(gòu)域。 ? 兩者的不同： ?進(jìn)化動力不同： 保守突變 非保守取代； ?進(jìn)化方向不同： 適應(yīng)突變的積累； ?進(jìn)化速度不同： 非常漫長 只需幾年、甚至幾天； ?進(jìn)化目標(biāo)不同： 適應(yīng)環(huán)境 超越生物學(xué)意義的要 求，探索所希望的蛋白質(zhì)在順序空間的可及性。 定向進(jìn)化與自然進(jìn)化的異同點(diǎn) ? 定向進(jìn)化的實(shí)質(zhì)是達(dá)爾文進(jìn)化論在分子水平上的延伸和應(yīng)用。 ?比色和熒光檢測為代表的高通量篩選方法得到了廣泛的應(yīng)用，是當(dāng)前酶的高通量篩選的主要研究和發(fā)展方向。 借助復(fù)雜的儀器設(shè)備的高通量篩選 ?高效液相色譜 , 質(zhì)譜和毛細(xì)管電泳也被用來檢測反應(yīng)速度，但是作為一種高通量篩選技術(shù)，這些方法測試成本較高，而且每天每臺儀器最高只能檢測幾百個樣品，方法的使用受到一定的限制。 ? 通過監(jiān)測反應(yīng)過程中的顏色和熒光的變化可以有效地監(jiān)測反應(yīng)的進(jìn)行。這種篩選可以在檢測平板中進(jìn)行，也可以在微孔滴定板中進(jìn)行，借助一些檢測儀器很容易實(shí)現(xiàn)高通量篩選。 ? 流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法 細(xì)胞經(jīng)熒光染色后，通過高速流動系統(tǒng)，排成單行，逐個通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行測定。使用微流控芯片。 基因突變庫的篩選方法 ? 活體篩選法 遺傳互補(bǔ)篩選法 ? 活體 離體篩選法 噬菌體展示法；細(xì)胞表面展示法（細(xì)
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