11酶工程酶的蛋白質(zhì)工程-展示頁(yè)
2024-08-31 02:05本頁(yè)面
【正文】 菌、纖毛蟲細(xì)胞、酵母等） ? 離體篩選法 1）核糖體顯示技術(shù) 2） RNA蛋白質(zhì)融合技術(shù) (RNA顯示技術(shù)） 定向進(jìn)化的篩選策略 ? 瓊脂板涂布法 在特殊條件下培養(yǎng)突變菌，通過宿主菌的生長(zhǎng)情況、培養(yǎng)基顏色、特定反應(yīng)的出現(xiàn)等判斷是否具有目的基因。 交錯(cuò)延伸 交錯(cuò)延伸 (stagger extension process, StEP) 在 PCR反應(yīng)中把常規(guī)的退火和延伸合并為一步 , 縮短其反應(yīng)時(shí)間，從而只能合成出非常短的新生鏈，經(jīng)變性的新生鏈再作為引物與體系內(nèi)同時(shí)存在的不同模板退火而繼續(xù)延伸。 ? 外顯子改組 (exon shuffling）類似于 DNA改組，與但與其不同，它是靠同一種分子間內(nèi)含子的同源性帶動(dòng)，而 DNA改組不受任何限制，發(fā)生在整個(gè)基因片段上。即將一次 PCR擴(kuò)增得到的有用突變基因作為下一次 PCR擴(kuò)增的模板，連續(xù)反復(fù)地進(jìn)行隨機(jī)誘變。 隨機(jī)突變的策略 ?易錯(cuò) PCR技術(shù) (errorprone PCR) ?DNA改組 (DNA shuflling)：由美國(guó) Stemmer 于 1994 年首次提出 一項(xiàng)體外重組技術(shù) ?隨機(jī)引發(fā)重組 (RPR) 1998 年 ,Arnold 提出了一種有效的新方法 ?交錯(cuò)延伸技術(shù) (StEP)：由 Zhao 等提出 , 是一種簡(jiǎn)化的 DNA shuffling 技術(shù) 易錯(cuò) PCR ?易錯(cuò) PCR（ error prone PCR）是指在擴(kuò)增目的基因的同時(shí)引入 堿基錯(cuò)配 ，導(dǎo)致目的基因隨機(jī)突變。 ? (2) 突變體應(yīng)能在適當(dāng)?shù)奈⑸?(如大腸桿菌或酵母菌 ) 體內(nèi)進(jìn)行功能的表達(dá) 。 ? 酶的體外定向進(jìn)化技術(shù)極大地拓展了蛋白質(zhì)工程學(xué)的研究和應(yīng)用范圍，特別是能夠解決合理設(shè)計(jì)所不能解決的問題，為酶的結(jié)構(gòu)與功能研究開辟了嶄新的途徑，并且正在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等領(lǐng)域逐漸顯示其生命力。 定向進(jìn)化技術(shù) 定向進(jìn)化＝隨機(jī)突變＋選擇 定向進(jìn)化的原理 體外定向進(jìn)化的意義 ? 理論上，蛋白質(zhì)分子蘊(yùn)藏著很大的進(jìn)化潛力，很多功能有待于開發(fā)，這是酶的體外定向進(jìn)化的基本先決條件。 酶的定向進(jìn)化 1993年 ,美國(guó)科學(xué)家 Frances H Arnold （ 加州理工大學(xué) ， 生物化學(xué)家 ） 首先提出酶分子的定向進(jìn)化的概念 ， 并用于天然酶的改造或構(gòu)建新的非天然酶 。衡量的標(biāo)準(zhǔn)是看它可能導(dǎo)致什么樣的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。有些蛋白質(zhì)雖然已經(jīng)測(cè)定了空間結(jié)構(gòu)，但其功能部位在哪里還不肯定，這樣的對(duì)象改造起來也有一定的盲目性。如果沒有測(cè)定出空間結(jié)構(gòu)，有沒有同源蛋白的空間結(jié)構(gòu)，如果都沒有，那就很難進(jìn)行以后的分子設(shè)計(jì)。 蛋白質(zhì)工程的這一程序不是一次就能實(shí)現(xiàn)的，往往要經(jīng)過多次的循環(huán)，不斷改進(jìn)設(shè)計(jì)方案才能發(fā)現(xiàn)一個(gè)理想的新改性蛋白。 當(dāng)前的分子設(shè)計(jì)主要以能顯示圖形圖象的計(jì)算機(jī)為工具，采用基于物理學(xué)原理的各種模擬方法和基于蛋白質(zhì)的改性分子結(jié)構(gòu)知識(shí)的模型構(gòu)建方法，或兼用這兩類方法。 空間結(jié)構(gòu)測(cè)定的專家： 主要應(yīng)用 X射線晶體結(jié)構(gòu)分析的方法與技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測(cè)定。 ? 由于定點(diǎn)突變首先獲得酶分子特征、空間結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)有功能之間的關(guān)系等信息，在此基礎(chǔ)上找出需要改造的部位，進(jìn)行酶分子的設(shè)計(jì)和改造，因此這種改造稱為酶分子的理性設(shè)計(jì)。 位點(diǎn)特異性突變 — 基于結(jié)構(gòu)生物學(xué)、信息生物學(xué) 基因突變 隨機(jī)突變 —— 基于高通量篩選法 基因剪接 基因內(nèi)部的剪接 5‘或 3’端的剪接 ? 定點(diǎn)突變（ 酶分子的理性設(shè)計(jì) ） ? sitedirected mutagenesis ? 酶分子基因序列中特定位點(diǎn)引入突變，這種突變包括特殊堿基的添加、刪除、取代等。 但目前主要是通過基因突變手段以制取天然蛋白質(zhì)的各種人工突變產(chǎn)物。 三級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定： ?X射線晶體衍射 —— 研究處在 晶體狀態(tài) 下的蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu) ?核磁共振 (NMR)光譜 —— 研究處在 溶液狀態(tài) 的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測(cè)定 一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定： ?直接法： 直接測(cè)定多肽鏈的氨基酸順序。 蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)依賴于其所含的氨基酸序列 , 而氨基酸的序列又由其編碼基因的核苷酸序列所決定。第七章 酶的蛋白質(zhì)工程 現(xiàn)代酶工程的要求 ? 能具備長(zhǎng)期穩(wěn)定性和活性 ? 能適用于水及非水相環(huán)境 ? 能接受不同的底物甚至是自然界不存在的合成底物 ? 能夠在特殊環(huán)境中合成和拆分制作新藥物或藥物的原材料 途徑 方法 優(yōu)點(diǎn) 不足 酶分子改造 核酸水平 蛋白質(zhì)工程 從根本上提高酶分子穩(wěn)定性 操作復(fù)雜，周期長(zhǎng) 蛋白質(zhì)水平 化學(xué)修飾 適應(yīng)所有酶，操作簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì) 修飾過程破壞酶分子 劑型 固定化 適應(yīng)所有酶，穩(wěn)定性高，可重復(fù)利用和連續(xù)生產(chǎn) 載量較低，易失活 交聯(lián)酶晶體 穩(wěn)定性好，載量高，催化效率高 成本高 微環(huán)境改良 穩(wěn)定劑 簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì) 工作量大
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