11酶工程酶的蛋白質(zhì)工程(編輯修改稿)
2024-09-12 02:05 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 。 借助復(fù)雜的儀器設(shè)備的高通量篩選 ?高效液相色譜 , 質(zhì)譜和毛細(xì)管電泳也被用來(lái)檢測(cè)反應(yīng)速度，但是作為一種高通量篩選技術(shù)，這些方法測(cè)試成本較高，而且每天每臺(tái)儀器最高只能檢測(cè)幾百個(gè)樣品，方法的使用受到一定的限制。 ?采用放射性同位素標(biāo)記底物進(jìn)行脂酶的篩選取得了較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這種方法靈敏而且準(zhǔn)確，但由于放射性其使用會(huì)受到限制無(wú)法推廣使用。 ?比色和熒光檢測(cè)為代表的高通量篩選方法得到了廣泛的應(yīng)用，是當(dāng)前酶的高通量篩選的主要研究和發(fā)展方向。 ?隨著生物催化在精細(xì)化工和醫(yī)藥行業(yè)的廣泛應(yīng)用，對(duì)手性純化合物的大量需求使手性酶的篩選成了當(dāng)前的研究熱點(diǎn)，同時(shí)產(chǎn)品價(jià)值的提高也將使得很多借助復(fù)雜儀器設(shè)備的高成本的檢測(cè)方法成為可能并將逐漸得到更多的應(yīng)用。 定向進(jìn)化與自然進(jìn)化的異同點(diǎn) ? 定向進(jìn)化的實(shí)質(zhì)是達(dá)爾文進(jìn)化論在分子水平上的延伸和應(yīng)用。 ? 定向進(jìn)化是在體外模擬突變、重組和選擇的自然進(jìn)化，使進(jìn)化朝著人們需要的方向發(fā)展。 ? 兩者的不同： ?進(jìn)化動(dòng)力不同： 保守突變 非保守取代； ?進(jìn)化方向不同： 適應(yīng)突變的積累； ?進(jìn)化速度不同： 非常漫長(zhǎng) 只需幾年、甚至幾天； ?進(jìn)化目標(biāo)不同： 適應(yīng)環(huán)境 超越生物學(xué)意義的要 求，探索所希望的蛋白質(zhì)在順序空間的可及性。 目標(biāo)酶 所需功能 方法 結(jié)果 實(shí)施菌種 卡那霉素核苷基轉(zhuǎn)移酶 熱穩(wěn)定性 定位誘變 +選擇 在 6050℃ 酶半衰期增加 200倍 耐熱脂肪芽孢桿菌 枯草桿菌蛋白酶 作用于有機(jī)溶劑 易錯(cuò) PCR+選擇 在 60％二甲基亞砜活力增強(qiáng) 170倍 枯草桿菌 β 內(nèi)酰胺酶 作用于新底物 DNA改組 +選擇 對(duì) cefotaxime的抗性增加 32022倍 大腸桿菌 對(duì)硝基苯酯酶 有機(jī)溶劑中的底物特異性和活性 易錯(cuò) PCR+重組 活力增加 60150倍 大腸桿菌 胸苷激酶 第五特異性 基因理療 交錯(cuò)延伸 +選擇 活力增加 43倍 大腸桿菌 β 半乳糖苷酶 底物特異性 DNA改組 +選擇 活力增加 66倍底物特異性增加 1000倍 大腸桿菌 砷酸脫毒途徑 砷酸抗性 DNA改組 +選擇 抗性增加 12倍 大腸桿菌 定向進(jìn)化的應(yīng)用 酶的半理性設(shè)計(jì)： 應(yīng)用部分已知的酶結(jié)構(gòu)或酶功能信息，或者通過(guò)隨機(jī)突變探測(cè)改變所需性質(zhì)的關(guān)鍵點(diǎn)，隨后選定一些位點(diǎn)進(jìn)行常規(guī)隨機(jī)突變或飽和突變，提高對(duì)目標(biāo)酶的改造。 設(shè)計(jì)方法： 1. 基于結(jié)構(gòu)信息的對(duì)特定片段的定點(diǎn)隨機(jī)突變 2. 隨機(jī)突變與特定氨基酸的位點(diǎn)飽和突變結(jié)合 3. 計(jì)算機(jī)輔助的半理性設(shè)計(jì) 基因內(nèi)部剪接 在編碼基因的內(nèi)部插入或剪去特定的序列、結(jié)構(gòu)原件或結(jié)構(gòu)域。 5’或 3’端的剪接 融合基因可以用于在體外產(chǎn)生不同基因或基因片段之間的融合，產(chǎn)生融合蛋白。 ① 避免目的蛋白在表達(dá)時(shí)被降解 ② 增加分泌性 ③ 提高溶解性 ? 重組酶的高效表達(dá) ? 一、細(xì)菌表達(dá)體系 ? 二、酵母系統(tǒng)中的表達(dá) ? 三、絲狀真菌中的表達(dá) 體系生產(chǎn)重組酶 常用宿主菌株的基因型 DH5： supE44, hsdR17, recA1, endA1, gyrA96, thi1, relA1 JM109: supE44, hsdR17, recA1, endA1, gyrA96, thi1, relA1 ?(lacproAB) / F’[traD36, proAB+, lacIq, lacZ ?M15 大腸桿菌表達(dá)載體必備元件： 二、 酵母表達(dá)系統(tǒng) 例 1： Cu／ Zn超氧化物歧化酶 (Cu/ZnSOD)是重要的醫(yī)用酶。大腸桿菌表達(dá)體系能將 N端的甲硫氨酸除去，但不能將第二個(gè)氨基酸 (Ala)乙?；?。 需用 真核系統(tǒng)表達(dá)！ 基因源：人的 Cu/ZnSOD cDNA基因 質(zhì)粒載體 ：釀酒 酵母 2 mm質(zhì)粒 啟動(dòng)子：酵母甘油醛磷酸脫氫酶 (GAPD)啟動(dòng)子 附加：轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)、 poly(A)信號(hào)。 宿主細(xì)胞 ： Leu缺陷型的 釀酒 酵母。 釀酒酵母表達(dá)質(zhì)粒 釀酒酵母誘導(dǎo)型表達(dá)載體的構(gòu)建 釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)的缺點(diǎn)： 嗜甲醇的酵母 (Pichia pastoris) 優(yōu)點(diǎn) ： 能在以甲醇為唯一碳源和能源的培養(yǎng)基中快速生長(zhǎng)。 乙醇氧化酶基因 aoxl的啟動(dòng)子是一個(gè)很強(qiáng)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子 ， 甲醇誘導(dǎo)時(shí) ， 酶產(chǎn)量可達(dá)總蛋白的 30％ 。 畢赤酵母載體包括自主復(fù)制的游離載體和整合型載體 ， 由于沒(méi)有穩(wěn)定的附加體質(zhì)粒 ， 所以一般用整合型質(zhì)粒作為外源基因的表達(dá)載體 。 宿主細(xì)胞為組氨酸脫氫酶缺陷型 (HIS4一 ) 牛溶菌酶基因在嗜甲醇酵母中的表達(dá) 牛溶
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