【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 搜尋所需要的產(chǎn)酶微生物；從菌種保藏中心篩選；從基因庫(kù)篩選6. 微生物發(fā)酵產(chǎn)酶的培養(yǎng)方式有哪些？固體發(fā)酵的培養(yǎng)：以麩皮、米糠為主要原料，加入其他必要的營(yíng)養(yǎng)成分，制成固體或半固體的麩曲后，進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶。液體深層發(fā)酵：采用液體培養(yǎng)基，經(jīng)滅菌、冷卻后接種產(chǎn)酶菌，在一定條件下發(fā)酵產(chǎn)酶。固定化細(xì)胞發(fā)酵：將細(xì)胞固定在水不溶性的載體上，在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行生命活動(dòng)而產(chǎn)酶。固定化原生質(zhì)體發(fā)酵：利于胞內(nèi)物質(zhì)透過細(xì)胞膜分泌到細(xì)胞外。7. 分析提高微生物產(chǎn)酶量的方法有哪些？（1）針對(duì)性地打破生物細(xì)胞內(nèi)酶蛋白的合成機(jī)制，可從兩方面入手：條件控制：發(fā)酵條件優(yōu)化：控制溫度、PH，優(yōu)化培養(yǎng)基，根據(jù)需求供給無菌空氣，掌控發(fā)酵周期，確定放罐時(shí)間，避免自溶。采用添加誘導(dǎo)物、解除阻遏物、流加等技術(shù)提高產(chǎn)酶量。（2）遺傳控制：包括基因突變和基因重組。8. 什么是基因重組？構(gòu)建基因工程菌的一般流程是什么？根據(jù)人們預(yù)先設(shè)想，利用酶學(xué)的方法，將目的基因重組到一個(gè)適宜的載體上，組成重組子，將重組子轉(zhuǎn)化到適當(dāng)受體細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增表達(dá)，以達(dá)到改造生物細(xì)胞目的的技術(shù)。流程：目的基因片段的產(chǎn)生和分離；目的基因片段共價(jià)連接到載體上，即體外重組；體外重組的雜合分子轉(zhuǎn)入合適的宿主；篩選和檢測(cè)。9. 設(shè)計(jì)一個(gè)實(shí)驗(yàn)方案從自然環(huán)境中篩選獲得一株產(chǎn)α淀粉酶的微生物，并獲取其編碼α淀粉酶的基因。簡(jiǎn)述該實(shí)驗(yàn)方案的基本原理，并描述實(shí)驗(yàn)流程。PCR擴(kuò)增后測(cè)序獲得基因序列第6章 酶的分離純化1. 酶提取、分離純化的一般技術(shù)路線。2. 細(xì)胞破碎的方法及其原理。填空機(jī)械破碎——通過機(jī)械運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的剪切力，使組織、細(xì)胞破碎。——搗碎法、研磨法、勻漿法；物理破碎——通過各種物理因素的作用，使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細(xì)胞破碎?！獪囟炔钇扑榉?、壓力差破碎法、超聲波破碎法；化學(xué)破碎——通過各種化學(xué)試劑對(duì)細(xì)胞膜的作用，而使細(xì)胞破碎。——有機(jī)溶劑：甲苯、丙酮、丁醇、氯仿，表面活性劑：Triton、Tween；酶促破碎——通過細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達(dá)到細(xì)胞破碎?！匀芊?、外加酶制劑法。3. 什么是鹽溶？什么是鹽析？鹽溶現(xiàn)象：大多數(shù)蛋白類酶都溶于水，而且在低濃度的鹽存在的條件下，酶的溶解度隨鹽濃度的升高而增加，稱為鹽溶現(xiàn)象。鹽析：在鹽濃度達(dá)到某一界限后，酶的溶解度隨鹽濃度升高而降低，這稱為鹽析現(xiàn)象。4. 酶沉淀分離的方法有哪些？鹽析沉淀、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑沉淀的原理。大題鹽析沉淀法、等電點(diǎn)沉淀法、有機(jī)溶劑沉淀法、復(fù)合沉淀法、選擇性變性沉淀法。鹽析沉淀原理：利用不同蛋白質(zhì)在不同的鹽濃度條件下溶解度不同的特性，通過在酶液中添加一定濃度的中性鹽，使酶或雜質(zhì)從溶液中析出沉淀，從而使酶與雜質(zhì)分離。等電點(diǎn)沉淀法原理：利用兩性電解質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低，以及不同的兩性電解質(zhì)有不同的等電點(diǎn)這一特性，通過調(diào)節(jié)溶液的pH值，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離。有機(jī)溶劑沉淀原理：利用酶與其他雜質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度不同，通過添加一定量的某種有機(jī)溶劑，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離。5. 什么是膜分離？膜分離的基本類型和截留的主要物質(zhì)。膜分離：借助于一定孔徑的高分子薄膜，將不同大小、不同形狀和不同特性的物質(zhì)顆?；蚍肿舆M(jìn)行分離的技術(shù)稱為膜分離技術(shù)?；绢愋停海?）加壓膜分離：微濾、超濾、反滲透；，超濾截留物質(zhì)為分子量在500以上的高分子，反滲透截留物質(zhì)為小分子物質(zhì)。（2）電場(chǎng)膜分離：電滲析、離子交換膜電滲析；陽膜截留陰離子，陰膜截留陽離子。（3）擴(kuò)散膜分離：透析。截留物質(zhì)為大分子溶質(zhì)。6. 什么是吸附層析？分配層析？離子交換層析？凝膠層析？親和層析？層析聚焦？各自的分離依據(jù)？吸附層析：利用吸附劑對(duì)不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物中各組分分離。分配層析：利用各組分在兩相中的分配系數(shù)不同，而使各組分分離的方法。離子交換層析：利用離子交換劑上的可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）對(duì)各種離子的親和力不同而達(dá)到物質(zhì)分離。凝膠層析：以各種多空凝膠為固定相，利用流動(dòng)相中所含各組分的相對(duì)分子質(zhì)量不同而達(dá)到物質(zhì)分離。親和層析：利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親和力，是生物分子分離純化。層析聚焦：將酶等兩性物質(zhì)的等電點(diǎn)特性與離子交換層析的特性結(jié)合在一起，實(shí)現(xiàn)組分分離。7. 對(duì)于某種酶制劑，如α淀粉酶，如何檢查其是否達(dá)到預(yù)期純化的精度要求？計(jì)算酶活力和比活力、回收率、提純倍數(shù)?；厥章剩禾峒兦芭c提純后酶的總活力之比，表示提純過程中酶損失程度大小?；厥章试礁邠p失越小提純倍數(shù)：提純前后比活力之比，這是表示提純過程中純度提高的倍數(shù)。提純倍數(shù)越大，表示該方法純化效果越好。第7章 固定化酶和細(xì)胞1. 酶固定化是為了克服游離酶應(yīng)用過程中的哪些缺點(diǎn)？（1） 酶的穩(wěn)定性較差：除了某些耐高溫的酶，以及胃蛋白酶等可以耐受較低的pH條件以外，大多數(shù)的酶在高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿和重金屬離子等外界因素影響下，都容易變性失活。（2） 酶的一次性使用：酶一般都是在溶液中與底物反應(yīng)，酶在反應(yīng)系統(tǒng)中與底物和產(chǎn)物混在一起，反應(yīng)結(jié)束后，即使酶仍有很高的活力，也難于回收利用。這種一次性使用酶的方式，不僅使生產(chǎn)成本提高，而且難于連續(xù)化生產(chǎn)。（3） 產(chǎn)物的分離純化較困難：酶反應(yīng)后成為雜質(zhì)與產(chǎn)物混合在一起，無疑給產(chǎn)物的進(jìn)一步分離純化帶來一定的困難。2. 什么是固定化酶？固定化酶的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)？ 固定化酶：在一定空間內(nèi)呈閉鎖狀態(tài)的酶，能連續(xù)的進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)后的酶可以回收重復(fù)利用。優(yōu)點(diǎn)：（1）不溶于水，易于與產(chǎn)物分離；（2）可反復(fù)使用；（3）可連續(xù)化生產(chǎn)；（4）穩(wěn)定性好。缺點(diǎn)：（1）固定化過程中往往會(huì)引起酶的失活；（2）首次制備成本較高；（3）適用于可溶性底物，尤其可溶性小分子底物，對(duì)大分子不適宜。3. 酶固定化有哪些方法，優(yōu)缺點(diǎn)？（1）非化學(xué)結(jié)合法：物理吸附法：利用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上，而使酶固定化的方法。優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，條件溫和，不會(huì)引起酶變性失活，載體廉價(jià)易得，而且可以反復(fù)使用。缺點(diǎn)是由于靠非化學(xué)吸附作用，結(jié)合力較弱，酶與載體結(jié)合不牢固而容易脫落，所以使用受到一定的限制。離子結(jié)合法：通過離子鍵使酶與載體結(jié)合的固定化方法。優(yōu)點(diǎn)是條件溫和，操作簡(jiǎn)單，制備過程中，活力損失較少。缺點(diǎn)是離子鍵結(jié)合力較弱，結(jié)合力不牢固，在pH和離子強(qiáng)度等條件改變時(shí)，酶容易脫落。（2）化學(xué)結(jié)合法：交聯(lián)法：借助雙功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)作用，制成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化酶的方法稱為交聯(lián)法。優(yōu)點(diǎn)是結(jié)合牢固，可長(zhǎng)時(shí)間使用。缺點(diǎn)是交聯(lián)反應(yīng)條件較劇烈，酶分子多個(gè)基團(tuán)被交聯(lián)，酶活力損失較大；顆粒較小，使用不便。共價(jià)結(jié)合法：通過共價(jià)鍵將酶蛋白分子上的反應(yīng)集團(tuán)與載體表面反應(yīng)基團(tuán)結(jié)合，從而使酶固定化的方法。優(yōu)點(diǎn)是結(jié)合牢固，固定化酶的穩(wěn)定性好，利于連續(xù)使用，不會(huì)因