【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 用藥物所特有的顏色反應(yīng)，測(cè)定解離藥物的含量；或者利用考馬斯亮藍(lán)法及福林—酚法測(cè)定蛋白的含量；5對(duì)于蛋白—蛋白結(jié)合物，可以通過SDS—PAGE電泳測(cè)定結(jié)合物的分子量，推算結(jié)合比。 參考文獻(xiàn)1．Avrames S，et al．Scand J Immunol 1978，8(suppl 7)：72，Kulkarni PN，et al．Cancer Res 1981 。 41:22700．3．Gallego J，et al．Int J Cancer l984；33：737．4．Johson JR，et al．Br J Cancer 1981，44：472．5．Raso V＆Grjffin T．J Immunol 1980；125：2610．6．Carsson J，et al．Biochem J 1978；173；723．7．Thorpe PE，et al．Cancer Res l987。 47:5924．8．WOrrell NR，et al．Anticancer Drug Design 1986；1：179．9．Philpott GW，et al．J Immun0l 1980。 125：1201．10．Weston PD，et al．Biochim Biophys Acta l980。 612：40．11．Nilsson P，et al．J Immunol Methods l981；41：81．12．宋振玉，等。藥學(xué)學(xué)報(bào)1985，20：610．13．Shih LB，et al．Int J Cancer l988；41：832．14；Diener E，et l986；231：148．15．Umemoto N，et al,Int J Cancer l989；43：677.16．Kato Y，et al．J Appl Biochem l983；5：313． 17．Kimtura I，et al．Cancer Immunol Immunother 1980。7:235．18．Umemoto N，et al．J Appl Biochem l984。 6：297．19．Hurwitz E，et al，J APpl 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當(dāng)用酶標(biāo)記抗原(E—Ag)檢測(cè)非標(biāo)記的待測(cè)抗原(Ag)時(shí)，兩者便與其特異抗體(Ab)發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)結(jié)臺(tái)作用，此即為競(jìng)爭(zhēng)性酶免疫分析的理論基礎(chǔ)：(E—Ag)十Ab——，(E—Ag)一Ab (F) 十 (B) 、Ag AgAb 游離(F)與結(jié)合(B)部分分離后，測(cè)其中(F)a或（B）分的酶活性，則與待測(cè)的非標(biāo)記抗原量成比例。此類分析方法專一強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便，在分子生物學(xué)、生化藥理、免疫藥理及臨床醫(yī)學(xué)研究中易于采用。 在配體結(jié)合的大分子生物活性物質(zhì)稱為結(jié)合劑。常用的結(jié)合劑有酶、抗體、受體和特異結(jié)合蛋白等(表2—1)。 目前，根據(jù)所用結(jié)合劑的不同，可將配體結(jié)合分析分為三大類：①以抗體為結(jié)合劑者為免疫分析；②以受體為結(jié)合劑者為受體分析；③以特異結(jié)合蛋白為結(jié)合劑者為競(jìng)爭(zhēng)蛋白結(jié)合分析。 以下簡(jiǎn)要列出上述三類配體結(jié)合分析的主要方法： (1)免疫分析(Immunoassay) A．放射免疫分析(1,2) B．酶免疫分析: a．非均相酶免疫分析(Heterogeneous Enzyme Immunoassay)或稱酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme Linked Imunosorbent Assay，ELISA)； b．均相酶免疫分析(Homogeneous Enzyme Immunoassay)或稱酶放大免疫測(cè)定技術(shù)(Enzyme Multipled Immunoassay Technique，EMIT)[3]； C，熒光免疫分析(F1uoroimmunoassay，F(xiàn)IA)[4]； D．發(fā)光免疫分析(Luminescent Immunoassay，LIA)[5]： a．生物發(fā)光免疫分析(Bi0luminescent Immun0assay，BLIA)； b．化學(xué)發(fā)光免疫分析(Chemiluminescent Immunassay，CLIA)； E．無標(biāo)記免疫分析(Markerfree Immunoassay)[6，7]： a。膠乳凝集免疫分析(Agglutination Latex Immunoassay)； b。顆粒計(jì)數(shù)免疫分析(Particle Counting Immunoassay，PACIA)； F．儀器免疫分析： a。激光濁度免疫分析(Laser NephelometriC Immunoassay，lNIA)； b．熒光偏振免疫分析(Fluorescence P0larization Immunoassay，F(xiàn)PIA)； (2)受體分析(Receptor Assay)[8]。 A．放射受體分析(Radio Receptor Assay，RRA)； B．酶受體分析(Enzyme Recept0r Assay，ERA)[9,10]； (3)競(jìng)爭(zhēng)蛋白結(jié)合分析(CompetitiYe Protein Binding Assay，CPBA)[11](二)配體結(jié)合分析中的標(biāo)記(即蛋白連接)技術(shù) 1．標(biāo)記物的種類 (1)放射性同位素：3H、125I； (2)非放射性標(biāo)記物1) 酶、輔酶、酶抑制劑；2) 熒光、生物發(fā)光及化學(xué)發(fā)光物質(zhì)；3) 金屬原子；穩(wěn)定自由基；4) 紅細(xì)胞、噬菌體；膠乳(Latex)； 。5) 毒素：白喉毒素、蓖麻毒素及紅豆毒素等，此類物質(zhì)不是用于配體結(jié)合分析的標(biāo)記物，而是用于免疫毒素的制備。2．標(biāo)記對(duì)象(被標(biāo)記物) *表示被標(biāo)記物(1)生物大分子(絕大多數(shù)為蛋白質(zhì))1) Ag或*Ab(●抗原或●抗體)；2) L—*R(配體—●受體)；3) Biotin—*Avidin(生物素—●抗生物素蛋白)[12]；4) *SPA—IgG(●金黃色葡萄球菌A蛋白—IgG)； 5) *PHA—OH—R(凝集素—糖基)。 (2)小分予物質(zhì) ①*H(*Hapten，即半抗原)或 ②*L(*Ligand，即配體)：包括各種藥物、毒物、固醇類激素等小分子物質(zhì)。 3．標(biāo)記方法概述(用于非放射性標(biāo)記物的標(biāo)記) (1)化學(xué)法 ①蛋白質(zhì)大分子之間的交聯(lián)：戊二醛法，高碘酸鈉法，SPDP法，苯酯法等； ②蛋白質(zhì)大分子與小分子配體或半抗原的交聯(lián)；碳化二亞胺法(EDC)，混合酸酐 (MA)法，琥珀酸酐法，N—經(jīng)基琥珀酰亞胺法等。 (2)生物親和配體交聯(lián)法(或稱間接標(biāo)記法) 標(biāo)記物本身既是(或作為)標(biāo)記物，又是被標(biāo)記物，通過與其相對(duì)應(yīng)的親和配體的親和結(jié)合作用，達(dá)到標(biāo)記之目的。常用的有以下幾種方法： (親) (親) (化)1) Ab——Biotin——Avidin——HRP (親) (化)2) IgG——SPA——HRP （ 親) (化)3) IgG(Abl)——antiIgG(Ab2)HRP4) 免疫學(xué)交聯(lián)法(或稱酶抗酶法，PAP)[l3]:Abl——Ab2——Ab1E(anti—HRP)HRP(E) 其中Ab1為第一種動(dòng)物的抗體，AblE為用同一種動(dòng)物的抗酶(HRP)抗體，Ab2為第二種動(dòng)物抗第一種動(dòng)物(IgG，即種屬球蛋白)的抗體，通常稱為第二抗體(Ab2)，亦稱抗種屬球蛋白。由上述三組(Ag—Ab)免疫反應(yīng)關(guān)系，達(dá)到用酶(HRP)對(duì)抗體(Ab1)的標(biāo)記，這種酶對(duì)抗體的交聯(lián)是不經(jīng)過任何化學(xué)交聯(lián)的免疫學(xué)親和標(biāo)記，故又稱為不標(biāo)記酶法。而在前三種生物親和配體交聯(lián)方法中，首先是生物親和結(jié)合作用，但是，酶的標(biāo)記還必需通過化學(xué)交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)，才能最后完成。 上述各種類型的標(biāo)記方法，根據(jù)所標(biāo)記的對(duì)象，大體上可分為兩類，一類是對(duì)大分子蛋白質(zhì)的標(biāo)記，另一類是對(duì)小分子物質(zhì)的標(biāo)記。以下則用酶作為非放射性標(biāo)記物的代表，簡(jiǎn)要介紹酶對(duì)蛋白抗原、抗體和小分子物質(zhì)的標(biāo)記，同時(shí)也將涉及半抗原(即無免疫原性的小分子物質(zhì))與蛋白載體的交聯(lián)——人工抗原合成制備中的若干問題。 二、酶 標(biāo) 記 技 術(shù) 通過化學(xué)反應(yīng)(在化學(xué)交聯(lián)劑的作用下)或親和結(jié)合作用，使酶與抗原、半抗原或抗體結(jié)合的過程，稱為酶的標(biāo)記或交聯(lián)。經(jīng)交聯(lián)所得之產(chǎn)物稱為酶標(biāo)記物或酶結(jié)合物。(簡(jiǎn)稱結(jié)合物)。 在酶免疫分析及其他各類配體結(jié)合分析中，標(biāo)記結(jié)合物的制備甚為重要，是此類方法的關(guān)鍵所在。一般說來，對(duì)酶結(jié)合物的要求，①具有高的酶活性；②具有高的抗原或抗體免疫活性：②穩(wěn)定性要好。在標(biāo)記反應(yīng)系統(tǒng)中，參與交聯(lián)反應(yīng)的組份，既有標(biāo)記物，又有被標(biāo)記物，同時(shí)還有化學(xué)或生物配體交聯(lián)劑，它們?cè)谝欢l件下，發(fā)生交聯(lián)而形成標(biāo)記結(jié)合物，此結(jié)合物的質(zhì)量既與各組份的純度、活性、穩(wěn)定性有關(guān)，也與所選擇的交聯(lián)劑和交聯(lián)方法有關(guān)。在嚴(yán)格控制交聯(lián)反應(yīng)條件下，使所得到的標(biāo)記產(chǎn)物——結(jié)合物，能保留各組份原有的活性，以便在此后的配體結(jié)合分析中，既能參與與配體高度專一的親和結(jié)合反應(yīng)，又不失去標(biāo)記組份的信號(hào)放大作用，以保證具有很高的靈敏度。除此之外，對(duì)所制備結(jié)合物的分離純化及鑒定也是標(biāo)記技術(shù)的必要步驟。 (一)在酶免疫分析(EIA)中所用的標(biāo)記酶 酶在EIA中作為標(biāo)記物，必須具有高活性、高純度、高穩(wěn)定性；酶在標(biāo)記過程的化學(xué)修飾及免疫反應(yīng)(或與配體結(jié)合)過程中其活性均無明顯變化；對(duì)酶活性的檢測(cè)方法要靈敏、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)易；酶源豐富價(jià)廉；同時(shí)，酶底物應(yīng)對(duì)人體健康無害。酶免疫分析，從其方法模型來看，可以分為兩大類，一類即“非均相酶免疫分析”，其中，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)是最常用的一種，也是大家很熟悉的，又稱固相酶免疫分析；另一類稱為“均相酶免疫分析”，最具代表性的是酶放大免疫測(cè)定技術(shù)(EMIT)，此類方法為美國Syva公司首創(chuàng)，目前國內(nèi)還未見報(bào)道[3，14]。在非均相酶免疫分析(ELISA)進(jìn)行過程中，結(jié)合的（B)與游離的(F)標(biāo)記酶活性沒有變化，因此，在對(duì)酶活性進(jìn)行測(cè)定之前，必需將(B)與(F)兩部分用物理的方法加以分離，以便曲定，(B)或(F)的酶活性，從而對(duì)待測(cè)物進(jìn)行定量分析。在均相酶免疫分析(EMIT)進(jìn)行過程中，由于酶標(biāo)結(jié)合物與抗體的結(jié)合，抗體(免疫球蛋白)大分子對(duì)酶的活性中心所引起的空間障礙或變構(gòu)效應(yīng)，從而使結(jié)合的(B)酶標(biāo)物與游離的(F)酶標(biāo)物之間的酶活性有明顯的變化(抑制或活化)，因此，在EMIT分析過程中，不需將結(jié)合的(B)與游離的(F)兩部分酶標(biāo)物進(jìn)行分離，而始終是在均一的液相體系中進(jìn)行反應(yīng)和酶活性測(cè)定。 由于酶免疫分析具有上述兩類截然不周的作用機(jī)理和方法模型，即ELISA和EMIT，所以兩者所用的標(biāo)記酶也不相同。ELISA所用的標(biāo)記酶以辣根過氧化物酶(HRP)為最廣泛，其次為堿性磷酸酯酶(AKP)(表2—2)[15]。在EMIT中，應(yīng)用最多的標(biāo)記酶是葡萄糖6—磷酸脫氫酶(G6PDH)，另外，蘋果酸脫氫酶(MDH)和溶菌酶 （lysozyme）這也使用（見表2—2）[14]。在這里應(yīng)該強(qiáng)調(diào)指出，在EMIT中所用的G6PDH應(yīng)該是由腸系膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides，LM．)來源的酶[16]，絕對(duì)不能使用由酵母來源的G6PDH，這是因?yàn)?，LM．—G6PDH對(duì)NAD’有高度的?！?，用這種酶可以排除溶血樣品的干擾，因?yàn)橄鄳?yīng)的人紅細(xì)胞膜G6PDH對(duì)NADP+是專一的，而酵母來源的G6PDH也對(duì)NADP+專一，易受影響，不能作為標(biāo)記酶。MDH的比活性較高，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，它僅適用于對(duì)尿樣的分析。 (二)標(biāo)記反應(yīng)中可利用的化學(xué)功能基團(tuán) 用酶作為標(biāo)記物，通常是對(duì)抗原、半抗原或抗體進(jìn)行標(biāo)記的；在ELISA中被標(biāo)記物可以是大分子抗原、抗體或其它蛋白類物質(zhì)；也可以是小分子半抗原、藥物、毒物、激素等而在EMIT中，從目前巳發(fā)表的文獻(xiàn)資料看，被標(biāo)記物幾乎全部都是小分子半抗原或藥物。如抗體是一種含糖的