【文章內(nèi)容簡介】 ， SFC)是以超臨界流體為色譜流動相的分離技術(shù)，可以在較低溫度下分析分子量較大、對熱不穩(wěn)定的 9 化合物和極性較強(qiáng)的化合物 ?？膳c各種氣相、高效液相色譜檢測器匹配 ?？膳c紅外、質(zhì)譜聯(lián)用。 SFC彌補(bǔ)了 GC和 HPLC的不足，適用于分析熱不穩(wěn)定而 HPLC又不易分析的化合物。許多在 GC或 HPLC上需要經(jīng)過衍生化才能分析的農(nóng)藥，都可以用 SFC直接測定。 SFC可與 SFE直接相聯(lián)，使樣品的提取、凈化和測定一次完成。 SFC與火焰光度檢測器連接還可以分析番茄和洋蔥中的樂果、馬拉硫磷等。 (2)色譜法 色譜法是根據(jù)分析物質(zhì)在固定相和流動相之間分配系數(shù)的差異達(dá)到分離目 的，當(dāng)樣品混合物在兩相相對運(yùn)動時，各組分在兩相中反復(fù)多次重新分配，結(jié)果 使混合物得到分離，通過將被分析物質(zhì)的濃度轉(zhuǎn)換成易被測量的電信號 (電壓、 電流等 )，并送到記錄儀記錄下來。目前應(yīng)用于農(nóng)藥殘留檢測的色 譜法主要有薄 層色譜法、氣相色譜法和高效液相色譜法薄層色譜。 ① 薄層色譜法 薄層色譜法是利用被檢測物經(jīng)顯色后同標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)磷農(nóng)藥 (OPS)比較來定性， 用薄層掃描儀來定量的測定方法。薄層色譜法顯色反應(yīng)類型多，顯色劑范圍廣， 快速，具有不受物質(zhì)的限定，在方法設(shè)計(jì)、擬定和實(shí)際應(yīng)用上機(jī)動靈活，適用于 對多種農(nóng)藥檢測與鑒定。薄層層析法設(shè)備簡單，操作方便，展開時間短，定性分 離效果好，適用于微量成分的分離和鑒定，也應(yīng)用于各種有機(jī)化合物如親水性物 質(zhì)或親脂性物質(zhì)等的分離、精制和鑒定分析。 20世紀(jì) 70年代， Kumar 等對膽堿酷酶使用的顯色基質(zhì)及薄層定量方法進(jìn)行了研究，近年來，國內(nèi)開始關(guān)注植物膽堿酷酶的研究。楊娟，阮長青等利用有機(jī)磷農(nóng)藥抑制植物膽堿酷酶活性的原理， 確定了小麥膽堿酷酶液與 Q 一乙酸蔡醋的酶促反應(yīng)過程中的最大吸收波長、顯色溫度、顯色時間以及酶液稀釋倍數(shù)。通過酶抑制法與薄層層析的逐步分離過程相結(jié)合分析實(shí)現(xiàn)了 10 種常用有機(jī)磷農(nóng)藥的定性分析 [6]，為分離有機(jī)磷農(nóng)藥多殘留以及植物膽堿酷酶抑制法快速檢測有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的深入研究提供依據(jù)。 ② 氣相色譜法 氣相色譜法 (GC)是以惰性氣體為流動相的柱色譜分離技術(shù)，是目 前檢測有機(jī)磷農(nóng)藥的國家標(biāo)準(zhǔn)方法，該方法是利用經(jīng)提取、純化、濃縮后的 OPs 注入氣相色譜柱，程序升溫氣化后，不同的 OPs 在固定相中分離，經(jīng)不同的檢測器檢測掃描繪出氣相色譜圖，通過保留時間來定性，通過峰或峰面積與標(biāo)準(zhǔn)曲線對照來 10 定量。具有即定性又定量、準(zhǔn)確、靈敏度高，并且一次可以測定多種成分的優(yōu)點(diǎn)。美國的 EPAMethod1657就是使用 GC來測定城市和工業(yè)廢水中的 45種有機(jī)磷農(nóng)藥 。袁慧娟，宋國新等采用 GC 從 s 技術(shù)對上市蔬菜中有機(jī)磷類農(nóng)藥 (甲胺磷、敵敵畏、久效磷、馬拉硫磷等 9 種 )殘留同時測定。蔬菜樣品經(jīng)超聲波提取、 簡單的凈化處理后可直接進(jìn)樣分析。樣品加標(biāo)回收率在 70%一 127%之間，檢測限為~[7]。該分析方法簡便、快速、準(zhǔn)確，適用于蔬菜中農(nóng)殘的定性定量分析。 ③ 高效液相色譜法 高效液相色譜 (HPLC)是以液體為流動相采用高壓輸液泵、高效固定相和高靈敏度檢測器等裝置的一種柱色譜分離技術(shù)，常用于揮發(fā)及熱不穩(wěn)定性的農(nóng)藥殘留分析。李永新等采用高效液相色譜柱分離、紫外檢測以及外標(biāo)法定量，建立了同時測定蔬菜水果中 12 種農(nóng)藥殘留的反相高效液相色譜分析方法。該方法的檢測限為 林留 L 一 協(xié)留 L。在水果中的平均加標(biāo)回收率為 %一%，在蔬菜中的平均加標(biāo)回收率為 %一 %[8]。陳珠靈等采用高效液相色譜法對蔬菜中甲基對硫磷、乙基對硫磷、甲拌磷進(jìn)行同時分離和檢測，以Shim一 packVP 一 ODS 為分離柱，紫外檢測波長為 250nm，該方法所測得的 3種有機(jī)磷在 ，檢出限達(dá) ，加標(biāo)回收率在 %一 %[9]。 目前檢測有機(jī)磷農(nóng)藥殘留普遍采用的方法 如色譜法、超臨界流體技術(shù)，檢測 結(jié)果準(zhǔn)確，靈敏度高，但成本高，測定時間長，且需要具有一定技術(shù)水平的專業(yè) 人員才能進(jìn)行操作，只適合在實(shí)驗(yàn)室分析 。而近些年來興起的酶抑制法具有操作 簡便，速度快，適合現(xiàn)場檢測、大批樣品篩選檢測以及我國小規(guī)模、分散的銷售 體系中經(jīng)常性的現(xiàn)場快速檢測，因此作為一種檢測農(nóng)藥的常用方法得到廣泛應(yīng) 用。而如何選擇酶源是實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確檢測的關(guān)鍵。 膽堿脂酶廣泛存在于動物的組織中， 1953年 stedman等首先從馬血清中分離 出乙酞膽堿脂酶，此后不同來源的乙酰膽堿脂酶相繼得到純化和研究 [10]。目前 已分離純化的動物來源的乙酰膽堿脂酶主要集中在動物肝臟和血液，如豬肝，雞 血等。也有利用蛆蝴以及海洋魚類，甲殼類動物的神經(jīng)組織，腦組織分離乙酰膽 11 堿脂酶 [11]~[13]。近年來很多學(xué)者致力于從昆蟲體內(nèi)提取乙酰膽堿脂酶如 :家蠅、麥二叉蚜、黃猩猩果蠅、煙草天蛾、光葉庫蚊、黃粉甲、美洲淤夜蛾、豆莢草盲蜷、馬鈴薯葉甲、騷擾角蠅、棉鈴蟲等。迄今為止，酶抑制法進(jìn)行農(nóng)藥殘留檢測以從敏感家蠅中提取的乙酰膽堿脂酶效果最佳，其敏感性優(yōu)于其他來源的乙酰膽堿脂酶，更有進(jìn)一步研究表明，家蠅羽化后 2一 3d 時其頭部的乙酰 膽堿脂酶敏感性最高。植物來源的脂酶作為農(nóng)藥殘留檢測的三種酶標(biāo)記物之一，由于其來源廣泛、價格低廉，近年來得到了較多的關(guān)注。但是，幾乎所有的研究都是直接以面粉作為酶源，篩選用于農(nóng)殘檢測的最佳小麥品種或者是以面粉作為酶標(biāo)記物，制成酶片，對酶片檢測農(nóng)殘顯色反應(yīng)的溫度、時間、顯色劑的選擇等方面進(jìn)行比較研究。尚未見到用提取純化的酷酶制品對大量有機(jī)磷農(nóng)藥的靈敏性和最低檢測限進(jìn)行研究的報(bào)道。 酶抑制法測定有機(jī)磷農(nóng)藥殘留是根據(jù)有機(jī)磷農(nóng)藥的毒性對酶分解底物的抑制作用進(jìn)行的，其酶源有來自動物 的膽堿酷酶和從植物中提取的植物酷酶。動物膽堿酷酶法是基于有機(jī)磷農(nóng)藥的毒性抑制乙酞膽堿酷酶催化底物水解生成乙酸和膽堿，后者與 5， 5一二硫代一雙一 2一硝基苯甲酸反應(yīng)，生成黃色產(chǎn)物 5一硫代一 2 一硝基苯甲酸，其在 410nln 處有最大吸收，測定其在單位時間內(nèi)的生成量，即可測得乙酞膽堿酷酶的活性。植物酷酶可以催化乙酸蔡酷水解為蔡酚和乙酸，蔡酚與顯色劑固 B 作用形成紫紅色的偶氮化合物，從而發(fā)生顯色反應(yīng)，具體反應(yīng)見下式。 12 有機(jī)磷農(nóng)藥能抑制植物脂酶的活性，使反應(yīng)速率發(fā)生變化，紫紅色的偶氮化 合物產(chǎn)量不同，吸光度值也 不同，即酶的活性受到抑制的程度不同 [14]。很多學(xué)者經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)，比較了動物脂酶和植物脂酶反應(yīng)的條件、總脂酶活力和靈敏度，并對其檢測條件進(jìn)行了優(yōu)化。 2021 年黃志勇等比較了快速測定蔬菜中有機(jī)磷農(nóng)殘的膽堿脂酶抑制法和植物脂酶抑制法，并通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了兩種酶抑制法的測定條件。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種酶抑制快速測定方法均可用于蔬菜中有機(jī)磷農(nóng)殘的測定，其加標(biāo)回收率都達(dá)到 85%以上，但植物脂酶法測量精密度更勝一籌 [14]。而后對植物脂酶和動物脂酶在不同 pH值下的酶活、抑制程度等性質(zhì)進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)研究也表明了動物脂酶中的蒼蠅酶、蠅蛆 酶與植物脂酶中的小麥脂酶相比，它們的活力和被農(nóng)藥抑制程度處于相近的水平 [15]?？梢姡参锟崦概c動物酷酶均可用于蔬菜中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的快速測定，而且兩種酶抑制法測量的精密度都較好，準(zhǔn)確度也相當(dāng)。與動物脂酶相比，植物脂酶的酶活、抑制程度等各項(xiàng)指標(biāo)均不遜色。此外，植物脂酶具有來源方便、成本低的優(yōu)勢，能夠穩(wěn)定而準(zhǔn)確地檢測到濃度為 103mol/L的敵敵畏，達(dá)到了其安全限值 [16]。 自從 1951年發(fā)現(xiàn)有機(jī)磷農(nóng)藥在體外也能抑制膽堿脂酶以來，絕大多數(shù)研究都 13 是基于動物膽堿脂酶這一原理進(jìn)行的。目前，膽堿脂酶法檢測有機(jī)磷的方法主要有酶片法、酶抑制分光光度法以及膽堿脂酶生物傳感器法。 (1)酶片法 酶片法是將敏感生物的膽堿脂酶和生色基質(zhì)液經(jīng)固化處理后加載到濾紙片或類似載體物質(zhì)上，基質(zhì)在膽堿脂酶的催化作用下迅速分解，生成膽堿 (藍(lán)色）和乙酸。有機(jī)磷和氨基甲酸酷農(nóng)藥對膽堿脂酶有抑制作用，使催化、水解、變色的過程發(fā)生改變。將膽堿脂酶與樣品提取液反應(yīng)，若膽堿脂酶受到抑制，基質(zhì)就不能水解、不變色，表明樣 品中含有機(jī)磷和氨基甲酸脂類農(nóng)藥 (呈陽性 )。目前廣泛使用的速測箱、速測卡法均屬于酶片法。近年來國內(nèi)常見的用固化含有膽堿脂酶和靛酚乙酸醋試劑的試紙片建立的適合我國蔬菜中部分農(nóng)藥殘留限量的現(xiàn)場監(jiān)督檢測的速測卡法，其檢出限一般在 g，檢出時間為 15min，操作簡單，速度快，測試成本低廉 [17]。也有學(xué)者利用馬血清中的乙酰膽堿脂酶與底物氯化乙酞膽堿作用，根據(jù)反應(yīng)前后的 pH值變化及指示劑的顏色變化情況，建立的一種可以作定性及半定量分析的酶片快速檢測法，應(yīng)用于實(shí)際檢測黃瓜中農(nóng)藥殘的效果較好 [18]。在國外 方面， Hwa一 YoungNO和 YoungAhKim等用涂有乙酰膽堿脂酶的試紙檢測樣品中農(nóng)藥殘留的含量，實(shí)驗(yàn)表明以 HybondN+為酶載體，苯基乙酸脂為底物最合適，此時有機(jī)磷和氨基甲酸酷類農(nóng)藥的檢出限分別為 :106～ 102和 106～ 100μg/mL， μ 實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn) :與對氧磷相比，試紙法對被氧化的對氧磷更敏感 [19]。 (2)酶抑制分光光度法 有機(jī)磷類農(nóng)藥對乙酰膽堿脂酶活性有抑制作用，濃度越高，抑制率越高。通過分光光度計(jì)測定吸光度隨時間的變化值，并與空白對照比較求得酶抑制率，從而判定樣品中是否有有機(jī)磷 或氨基甲酸酷類農(nóng)藥的存在。該法所需儀器設(shè)備簡單、靈敏度高、前處理簡單、檢測時間短，可及時檢測含農(nóng)殘的蔬菜。曾有報(bào)道以雞腦為酶源提取乙酞膽堿醋酶，利用酶抑制分光光度法檢測油白菜中有機(jī)磷農(nóng)藥 (對硫磷、辛硫磷、氧化樂果 )的殘留量，可使 3種農(nóng)藥的回收率分別達(dá)到 97%，101%和 99%。 Ingridwalt等從鐮刀菌 pisi 中提取角質(zhì)酶，利用酶抑制分光光度法和 %孔板法同時檢測多個樣品中有機(jī)磷和氨基甲酸酷類殺蟲劑的含量，該法對毒死蟀和對氧磷的檢測限分別為 。 14 (3)膽堿酷酶生物傳感器 膽堿 醋酶生物傳感器法是目前農(nóng)藥殘留速測技術(shù)中的研究熱點(diǎn)，其在研究方法多樣化、靈敏度、準(zhǔn)確性、響應(yīng)時間等方面都具有很大優(yōu)勢。方法較為多樣化，主要包含了電化學(xué)型、光化學(xué)型以及壓電型，與本文關(guān)系不大，不做具體介紹。 酶法快速檢測農(nóng)藥殘留的方法中，多采用敏感家蠅頭部獲得的乙酞膽堿醋 酶，但是動物酷酶常表現(xiàn)為保持期短，需冷凍低溫保存。而植物酷酶酶源豐富， 提取和保存較為方便，只需以一定比例的水或緩沖液混合離心獲得的上清液即可 作為粗酶液，并在一 4℃ 保存即可。而且與動物醋酶相比，植物酷酶抑 制法的測量準(zhǔn)確度和精密度均不遜色，能達(dá)到快速檢測農(nóng)藥殘留的目的。 1987 年，中國農(nóng)業(yè)部環(huán)保所研制出一種酶片和顯色基質(zhì)片，不需儀器，即可在田間或菜市場快速測定蔬菜和水果中的有機(jī)磷類農(nóng)藥，其檢測限為 10mg/kg。而后有人利用自制的植物酶片和高靈敏度化學(xué)檢測液 (速測靈 )，使檢測出有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的靈敏度達(dá)到 一 10mg/L和 一 10mg/kg，檢測時間為 5 一 10min，檢測成本為 一 元人民幣 [20,21]。至此，植物酷酶法檢測有機(jī)磷農(nóng)藥殘留開始受到了研究學(xué)者的廣泛關(guān)注，各方面的研究也隨 即展開。在酶源的篩選方面，依據(jù)對有機(jī)磷農(nóng)藥的敏感性而定，許多研究者直接從面粉中提取酶，但不同的小麥酶對農(nóng)藥的敏感性不同即使對于同一品種小麥，產(chǎn)地不同、種植方法不同、所處生長期不同時，其對農(nóng)藥的敏感度也會存在較大差異。因此，需要作進(jìn)一步的研究，以確定可以進(jìn)行定量分析而且具有互換性的植物脂酶酶源。在顯色液方面，由于酶抑制法檢測農(nóng)藥殘留常需借助于固藍(lán) B 鹽和乙酸萘脂組成的生色基質(zhì)液的顯色完成。但該顯色液非常不穩(wěn)定，在室溫下 40min以后顯色能力大大下降，不能再用來測定，需現(xiàn)用現(xiàn)配，這給檢測工作帶來了諸