【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 蒸餾水中，調(diào)節(jié) pH 至 ，高壓滅菌 20 min。 ⑤10M （ 5 % Methanol，甲醇）：將 15 mL 甲醇與 285 mL 蒸餾水混合，過(guò)濾除菌后 4 ℃ 保存?zhèn)溆谩? （ 2）常用培養(yǎng)基的制備 ①BMGY 培養(yǎng)基：稱取 5 g 酵母提取物， 10 g 胰蛋白胨，溶于 350 mL 蒸餾水中，高壓滅菌 20 min，然后冷卻至室溫，再加入 50 mL 10YNB 、 1 mL 500B 、50 mL 10GY 、 50 mL 1 mol/L K3PO4（ pH ），最后 4 ℃ 保存?zhèn)溆谩? ②BMMY 培養(yǎng)基：稱取 5 g 酵母提取物， 10 g 蛋白胨，溶于 350 mL 蒸餾水中，高壓滅菌 20 min，然后冷卻至室溫，再加入 50 mL 10YNB 、 1 mL 500B 、 50 mL 10M 、 50 mL 1 mol/L K3PO4（ pH ），最后 4 ℃ 保存?zhèn)溆谩? （ 3） SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳溶液的配制 6 ①30 % 凝膠儲(chǔ)液：稱取 g Acr， g Bis，加 100 mL 蒸餾水溶解。 ② 分離膠緩沖液：稱取 g Tris， 48 mL 1 mol/L HCl，加 100 mL 蒸餾水溶解。 ③ 濃縮膠緩沖液：稱取 g Tris， 48 mL 1 mol/L HCl，加 100 mL 蒸餾水溶解。 ④ 電極緩沖液：稱取 g SDS， 9 g Tris， g 甘氨酸，加 1500 mL蒸餾水溶解。 ⑤1 mol/L 、 pH TrisHCl 緩沖液：稱取 g Tris，加 800 mL 蒸餾水溶解 ， 再加 70 mL 1 mol/L HCl，混勻后 調(diào)節(jié) pH 至 ，最后加蒸餾水定容至1000 mL。 ⑥ 樣品緩沖液：取 1 mL TrisHCl 緩沖液， g SDS， g 溴酚藍(lán)， 2 mL甘油， mL β 巰基乙醇，加 10 mL 蒸餾水溶解。 ⑦10 % 過(guò)硫酸銨：稱取 1 g 過(guò)硫酸銨，加 10 mL 蒸餾水溶解（現(xiàn)用現(xiàn)配）。 ⑧ 固定液：取 45 mL 95%乙醇， 10 mL 冰醋酸，加 100 mL 蒸餾水。 ⑨ 染色液：稱取 g 考馬斯亮藍(lán) R250，加入 135 mL 95%乙醇， 30 mL冰醋酸，加 300 mL 蒸餾水，混勻，用濾紙過(guò) 濾。 ⑩ 脫色液：取 70 mL 冰醋酸， 200 mL 乙醇，加 1000 mL 蒸餾水。 （ 4）膠體幾丁質(zhì)的制備 ① 稱取 10 g 片狀幾丁質(zhì)（剪碎）置于 500 mL 三角瓶中，加 100 mL 濃鹽酸浸泡，然后放入 37 ℃ 搖床中至幾丁質(zhì)完全溶解， 4 ℃ 過(guò)夜。 ② 向溶液中加入 500 mL 50 % 乙醇，不斷攪拌至析出膠體，然后 5000 r/min離心 5 min，棄掉上清液。 ③ 在膠體中再加蒸餾水，攪拌后 5000 r/min 離心 5 min，重復(fù)上述過(guò)程至pH 約為 。 （ 5） DNS 的制備 ① 取 g DNS， 加 500 mL 水， 45 ℃ 水浴溶解。 ② 逐步加入 NaOH 溶液（ 20 g 溶于水），不斷攪拌至溶液清澈透明。 ③ 然后加入 91 g 酒石酸鉀鈉， g 苯酚和 g 無(wú)水亞硫酸鈉。 ④45 ℃ 水浴，同時(shí)加水不斷攪拌至全溶。 7 ⑤ 停止加熱，冷卻至室溫，用水定容至 1000 mL 。 ⑥ 將液體儲(chǔ)存于棕色瓶，避光保存 7 d， 備 用。 （ 6）廣泛 pH緩沖液 稱取 g 檸檬酸 、 g 磷酸二氫鉀 、 g 硼酸 、 g 巴比妥 ， 加 1 L 蒸餾水溶解。 主要儀器設(shè)備 Anke DL5B低速大容量離心機(jī)， Anke TGL16C 高速臺(tái)式離心機(jī)， 恒溫水浴鍋，雙層全溫?fù)u床（上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）， UV20xx 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)， DYY12 型電腦三恒多用電泳儀 、 WD9412A 型恒溫循環(huán)器、 WD9405A 型脫色搖床 （北京市六一儀器廠），夾心式垂直板電泳槽。 實(shí)驗(yàn)方法 酵母工程菌的培養(yǎng)和幾丁質(zhì)酶的誘導(dǎo)分泌表達(dá) （ 1）挑取 GStachit1K 單菌落，接種到含 25 mL BMGY 培養(yǎng)基的 250 mL搖瓶中，用紗布封口，放到搖床中， 28 ℃ 、 130 r/min 振蕩培養(yǎng) 3 d 至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（ OD600為 26）。 （ 2）將 BMGY 培養(yǎng) 物 以 5000 r/min 離心 1015 min，回收酵母細(xì)胞，棄掉上清液，將細(xì)胞重懸于 BMMY 培養(yǎng)基中 ，至 OD600值為 （ 約 100~200 ml）。 （ 3） 將培養(yǎng)液置于 500 mL 搖瓶中， 用 雙層 紗布封口，在搖床中 2830 ℃繼續(xù)培養(yǎng)并開(kāi)始誘導(dǎo)表達(dá)（注意溫度不要超過(guò) 30 ℃ ）。 （ 4） 誘導(dǎo)開(kāi)始后，每天補(bǔ)加 100 % 甲醇使終濃度維持在 %。 （ 5） 誘導(dǎo)開(kāi)始后，每天取樣一次，直至第 7 天。每次取樣 3 mL 于 mL離心管中 20 ℃ 保存。樣品用于制作產(chǎn)酶曲線和蛋白電泳。 N乙酰氨基葡萄糖（ NAG）標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 表 1 NAG 濃度的配制 Tab. 1 Standard curve of NAG 項(xiàng)目 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 NAG 標(biāo)準(zhǔn)液（ mL） NAG 的量（ mg） 蒸餾水（ mL） DNS（ mL） ① 配制 1 g/mL N乙酰氨基葡萄糖 （ NAG） 溶液。 8 ② 取 11 支 25 mL 按 (表 1)加入試劑，將各管混勻，沸水浴煮沸 10 min。 ③ 取出后立即用冷水冷卻至室溫，再向每試管加入 3 mL 蒸餾水，混勻。 ④ 測(cè) 540 nm 處的吸光值， 以蒸餾水為空白調(diào)零，每組 3 個(gè)重復(fù)。 ⑤ 以 NAG 濃度（ mg/mL）為橫坐標(biāo)， OD 值為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。 酵母工程菌產(chǎn)酶曲線的測(cè)定 將保存的 粗酶液樣品取出，幾丁質(zhì)酶活性測(cè)定參照 Antoni 和 Masarus 方法[6,7]， 并加以改進(jìn)。 1 mL 膠體幾丁質(zhì)與稀釋的 mL 酶液放于 50 ℃ 水浴保溫 1 h， 上清液中的還原糖 采用 DNS 法測(cè)定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線 得出 還原糖的含量，然后計(jì)算酶活。 酶活性單位（ U）定義為：每分鐘水解幾丁質(zhì)產(chǎn)生 1 mg 還原糖所需的酶蛋白量 [8]。 幾丁質(zhì)酶的分離純化 粗酶液的制備 根據(jù)分析最佳收獲時(shí)間為 7 d。第 7 天 終止發(fā)酵 收集發(fā)酵液。將發(fā)酵液 5000 r/min 離心 1015 min，收集上清液 即為粗酶液 。 硫酸銨沉淀 向提取的粗酶液中加入固體硫酸銨至 80%飽和度， 冰 浴后過(guò)夜。以 5000 r/min離心 15 min，收集沉淀。用適量 50 mmol/mL pH TrisHCl 緩沖液溶解，并在 相同緩沖液中透析 23 d，取少量溶液加 BaCl2檢測(cè)是否透析完全。透析完全后，將透析液以 5000 r/min 離心 15 min，取上清液， 80℃ 保存。 幾丁質(zhì)酶的 SDSPAGE 檢測(cè) 對(duì)純化酶液和 17 d的粗酶液進(jìn)行 SDSPAGE，測(cè)定 表觀 幾丁質(zhì)酶的分子量。 （ 1）分離膠凝膠液與濃縮膠凝膠液的配制 ①12 % 分離膠凝膠液：取 mL 30 % 凝膠儲(chǔ)液， mL 分離膠緩沖液， mL 10 % SDS， mL ddH2O， 30 μl 10 % 過(guò)硫酸銨， 30 μl TEMED ，混勻。 ②3 % 濃縮膠凝膠液：取 mL 30 % 凝膠儲(chǔ)液， mL 濃縮膠緩沖液， μl 10 % SDS ， mL ddH2O， 15 μL 10 % 過(guò)硫酸銨， 10 μL TEMED ，混勻（現(xiàn)配現(xiàn)用）。 9 （ 2）電泳操作 [9] ① 按照順序安裝玻璃板，然后沿兩板縫隙加入 15 % 融化的瓊脂，待瓊脂凝固后加入現(xiàn)配的 12 % 分離膠凝膠液，至膠面距低板邊緣 3 cm 左右，然后用滴管在膠面上輕輕鋪?zhàn)?1 cm 水層，垂直放置膠板，室溫下放置 30 min 待膠凝聚。凝聚后用濾紙吸出膠面上的水。 ② 將 3 % 濃縮膠凝膠液迅速注入分離膠上層，使液面與低板邊緣齊平，插入梳子。室溫下放置 2 h，待其完全凝聚。凝聚后小心拔出梳子，在玻璃 板兩側(cè)倒入電極緩沖液。 ③ 將 17 d 的粗酶液離心，取 50 μL 上清再加入 50 μL 上 樣緩沖液，對(duì)照組用提純的酶液?；靹蚝笤诜兴兄?10 min，冷卻后用微量加樣器將 25 μL 樣品和低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分別注入加樣孔中。 ④ 將電泳槽與電泳儀相連，電壓保持 100 V 進(jìn)行電泳，至樣品遷移至玻璃板下端 1 cm 時(shí)停止電泳。 （ 3）染色及脫色 ① 將電泳完畢的凝膠取出，用去離子水沖洗，然后放到考馬斯亮藍(lán) R250染色液中染色，過(guò)夜。 ②棄去染色液，凝膠沖洗后置于固定液中固定。 ③ 將凝膠置于 500 mL 脫色液中脫色， 至 膠脫 色完全。 ④ 脫色后，將膠板置于去離子水中室溫下保存。 （ 4） 分子量測(cè)定 已知 標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白質(zhì)（低）各電泳條帶的分子量，通過(guò)電泳圖估計(jì)幾丁質(zhì)酶的分子量 [10]。 幾丁質(zhì)酶 的酶學(xué)性質(zhì) 幾丁質(zhì)酶反應(yīng)的最適溫度 將 酶反應(yīng)體系 分別置于 30 ℃ 、 35 ℃ 、 40 ℃ 、 45 ℃ 、 50 ℃ 、 55 ℃ 、 60 ℃ 、65 ℃ 、 70 ℃ 、 75 ℃ 和 80 ℃ 下反應(yīng) 1 h， DNS 法檢測(cè)幾丁質(zhì)酶的活性，確定酶反應(yīng)的最適溫度。最高的酶活力定義為 100％，分別計(jì)算不同溫度條件下幾丁質(zhì)酶的相對(duì)酶活性（即在不同溫度下 的酶活性占最高酶活性的百分比）。 幾丁質(zhì)酶反應(yīng)的最適 pH 值 10 用廣泛 pH緩沖液將酶反應(yīng)體系 pH 值調(diào)為 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 測(cè)定幾丁質(zhì)酶活性。將最高的酶活力定義為 100 ％，分別計(jì)算不同 pH 值條件下幾丁質(zhì)酶的相對(duì)酶活性（方法同上）。 幾丁質(zhì)酶的 熱穩(wěn)定性 先將酶液分別置于 30 ℃ 、 35 ℃ 、 40 ℃ 、 45 ℃ 、 50 ℃ 和 55 ℃ 下保溫不同的時(shí)間（ 10 min、 20 min、 30 min、 40 min、 50 min、 60min）后，立即在 0 ℃冰浴中冷卻，然后加入幾丁質(zhì)在 50 ℃ 反應(yīng) 1 h ，測(cè)定幾丁質(zhì)酶活性，以剩余的酶活性作為酶的熱穩(wěn)定性的指標(biāo)。將最高的酶活力定義為 100％，分別計(jì)算不同溫度條件下幾丁質(zhì)酶的相對(duì)酶活性。 幾丁質(zhì)酶的 pH 值穩(wěn)定性 將酶液分別在 pH 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 的緩沖液中 處理 1 h 后，然后再將反應(yīng)體系的 pH值調(diào)至 ，測(cè)定剩余的酶活性。將最高的酶活力定義為 100％，分別計(jì)算不 同 pH 值條件下幾丁質(zhì)酶的相對(duì)酶活性。 不同金屬離子對(duì)酶活性的影響 在幾丁質(zhì)酶反應(yīng)體系中加入不同的金屬離子（ Cu2+、 Ca2+、 Mn2+、 Fe2+、 Zn2+、Ba2+、 K+、 Na+、 Ag+、 Mg2+、 NH4+ 、 Hg+）并使其最終濃度為 mol/L，在 50 ℃下反應(yīng) 1 h 后，以 反應(yīng)體系 中 不加金屬離子的酶活 性 為