【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 連續(xù)反應(yīng)的成功[44]。圖113 合成殼中殼結(jié)構(gòu)微囊的一般步驟[44]這種結(jié)構(gòu)還被用來(lái)藥物傳遞過(guò)程中的遠(yuǎn)程控制，如Andre G. Skirtach在內(nèi)殼中加入金的納米顆粒，通過(guò)激光激發(fā)使得內(nèi)殼膜破裂，釋放內(nèi)殼中的藥物[46]。最近，針對(duì)分區(qū)結(jié)構(gòu)，Mihaela Delcea等人有提出了同中心的（concentric）, 旁中心的（pericentric），內(nèi)中心的(innercentric)，無(wú)中心的(one anisotropic: acentric)四種基本結(jié)構(gòu)[47]。姜艷軍采用仿生鈦化過(guò)程構(gòu)建AlgProTi 雜化微囊作為多酶微工廠“廠房，以LbL 微囊作為工作車(chē)間，實(shí)現(xiàn)了多酶體系內(nèi)部的功能分割，便于單獨(dú)調(diào)節(jié)每種酶的催化特性可將不同酶種分別固定在LbL 微囊，shellsinShell結(jié)構(gòu)多酶微工廠中，囊壁孔徑分布主要集中在2~8nm，既能保證酶分子不泄漏，又能保證底物和產(chǎn)物分子的自由進(jìn)出。將多酶共包埋在一個(gè)局限空間內(nèi)，縮短了多酶活性位點(diǎn)的距離，能提高反應(yīng)發(fā)生的幾率和效率，在不同“車(chē)間”（LbL微囊）內(nèi)的酶組成“酶催化裝配線”，高效“加工”輸入的底物分子[64]。圖 114 capsulesinbead結(jié)構(gòu)的多酶微工廠的構(gòu)建 本文選題思路及主要工作酶的固定化對(duì)于酶的應(yīng)用起到非常重要的作用，當(dāng)前對(duì)于單個(gè)酶的包埋研究較多，對(duì)于雙酶以及多酶的固定化研究較少。因此，發(fā)展多酶的固定化方法將是未來(lái)固定化酶領(lǐng)域重要的發(fā)展方向。根據(jù)國(guó)內(nèi)外的研究進(jìn)展，結(jié)合課題組的優(yōu)勢(shì)，欲利用生物仿生硅化的層層組裝方法來(lái)制造一種shell in shell 的結(jié)構(gòu)，并且利用這種結(jié)構(gòu)包埋具有串聯(lián)作用的兩種酶，進(jìn)而檢測(cè)這種結(jié)構(gòu)在包埋多酶系統(tǒng)上的效果。主要研究?jī)?nèi)容： 以碳酸鈣為模板，仿生硅化與層層組裝制備雙殼結(jié)構(gòu) 利用掃描電子顯微鏡（SEM）、透射射電鏡（TEM）、熒光顯微鏡對(duì)制備的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征 利用X射線能譜儀(EDS)、傅立葉變換紅外光譜儀 (FTIR)對(duì)合成的微囊進(jìn)行元素和化學(xué)組成分析，利用化學(xué)吸附儀（BET）對(duì)合成的結(jié)構(gòu)孔徑進(jìn)行表征 研究了固定化葡糖糖氧化物GOx和辣根過(guò)氧化酶HRP的最適反應(yīng)溫度 測(cè)試了固定化后的酶的重復(fù)使用穩(wěn)定性第二章 Celllike shell in shell 載體結(jié)構(gòu)的制備 引言為了能夠?qū)崿F(xiàn)雙酶或多酶的固定化，需要?jiǎng)?chuàng)造像細(xì)胞一樣的分區(qū)結(jié)構(gòu)來(lái)分別包埋具有聯(lián)系的幾種酶，而細(xì)胞中最大的分區(qū)結(jié)構(gòu)應(yīng)該是細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)之間的分區(qū)，整個(gè)細(xì)胞如果去掉細(xì)胞器的話，可以看成由一個(gè)細(xì)胞核在中央，形成一個(gè)區(qū)域，在這個(gè)區(qū)域里，有DNA和一些DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄的酶；在核膜之外，細(xì)胞膜之內(nèi)，是另一個(gè)區(qū)域，有蛋白質(zhì)翻譯的所需的酶；這樣的分割使得蛋白質(zhì)的形成過(guò)程分割在兩個(gè)區(qū)域里，即互不干擾，又能通過(guò)核膜相互聯(lián)系，使得細(xì)胞中成千上萬(wàn)中蛋白質(zhì)翻譯進(jìn)行的井井有條。而分區(qū)結(jié)構(gòu)中，shell in shell這種結(jié)構(gòu)和細(xì)胞核細(xì)胞的結(jié)夠很相近，因此制備這種結(jié)構(gòu)來(lái)包埋兩種酶應(yīng)該可以獲得良好的效果。 實(shí)驗(yàn)過(guò)程 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器試劑表21 試劑的生產(chǎn)廠家和規(guī)格名稱(chēng)規(guī)格生產(chǎn)廠家硅酸鈉分析純天津大學(xué)科威公司無(wú)水碳酸鈉二水氯化鈣聚苯乙烯磺酸鈉（PSS）乙二胺四乙酸鈉(EDTA)精蛋白聚乙二醇600十二烷基磺酸鈉SDS羧甲基纖維素鈉CMC異硫氰酸熒光素(FITC)羅丹明B分析純分析純分析純分析純GradeⅡ, salmon分析純分析純分析純分析純分析純天津大學(xué)科威公司天津大學(xué)科威公司Sigma公司天津市頂?；た倧SSigma公司天津大學(xué)科威公司Sigma公司天津市金瑞特化學(xué)公司Sigma公司Sigma公司儀器表22 儀器的生產(chǎn)廠家和規(guī)格名稱(chēng)規(guī)格生產(chǎn)廠家掃描電子顯微鏡XL30ESEMPhilips 公司透射電子顯微鏡離心機(jī)數(shù)字pH計(jì)恒溫磁力攪拌器射線光電子能譜儀X 射線能譜儀熒光顯微鏡冷凍干燥機(jī)JEOLSigma315PHS2FEMS8APHI1600 ESCAISIS300Olympus BX51ALPHR 12日本電子Sigma 公司上海精密科學(xué)儀器有限公司天津市歐諾儀器儀表有限公司PerkinElmer 公司Oxford 公司Olympus公司Christ公司 含PSS 碳酸鈣核的制備將Na2CO3和CaCl2取20mL CaCl2溶液，加入60mg PSS粉末，使其完全溶解。在磁力攪拌（~600rpm）下迅速加入等體積的Na2CO3溶液，持續(xù)攪拌20s，靜置1530min，即制得PSS摻雜的碳酸鈣(CaCO3(PSS))膠體微粒。將所得粒子用離心法快速收集，用水洗滌三次，貯存?zhèn)溆谩?層層組裝制備精蛋白氧化硅(ProtamineSilica)2微囊 NaCl溶液中，各配成2mg/mL的溶液。取一定量CaCO3 (PSS)微粒置于離心管中（粒子濃度約為1% w/w），用水洗滌兩次，每次洗滌后3000rpm離心3min以除去上清液。往離心管中加入如上配制的精蛋白溶液，使CaCO3(PSS)重新分散，孵化15min，期間輕微振蕩離心管使碳酸鈣粒子分散；離心去上清液，加入水洗滌碳酸鈣粒子，重復(fù)兩次。然后往組裝有一層精蛋白的粒子中加入30mM的硅酸鈉溶液，使粒子重新分散，孵化15min，期間輕微振蕩，然后離心去上清液，水洗兩次。重復(fù)以上過(guò)程，在CaCO3 (PSS)微粒表面交替吸附精蛋白和硅酸鈉，組裝兩個(gè)雙層后得到核殼結(jié)構(gòu)的膠體粒子。 共沉淀制備碳酸鈣覆蓋(ProtamineSilica)2球中球結(jié)構(gòu)取約1/4上述帶有雙層(ProtamineSilica)2碳酸鈣核，重新分散于20ml CaCl2溶液中，加入60mg PSS以及 50mg PEG6000，在1000rpm的轉(zhuǎn)速下攪拌5min，將20ml Na2CO3迅速加入，攪拌20s，靜置20min。 分離出 shell in shell 結(jié)構(gòu)將以上所獲得的微球分散于500ml 純水中，攪拌2mim，置于超聲中超聲5min，自然沉降34mim，除去上清液，獲得shell in shell 結(jié)構(gòu)的微球。 Shell in shell結(jié)構(gòu)制備在分離出的shell in 的EDTA 去核，反應(yīng)30min，3000rpm 離心3min，去上清液。以上過(guò)程重復(fù)35 次，以徹底除去碳酸鈣，去核后得微囊，以水洗滌三次，水中貯存?zhèn)溆谩?Shell in shell結(jié)構(gòu)表征SEM/EDS：將微囊或微粒的懸浮液稀釋后滴在干凈的玻璃片上，自然干燥。噴金后采用掃描電子顯微鏡SEM 進(jìn)行觀察。SEM 附帶的X 射線能譜儀（EDS）分析樣品的元素組成。TEM：將將微囊或微粒的懸浮液稀釋后滴在銅網(wǎng)上，在掃描隧道顯微鏡下觀察。熒光顯微鏡：取一定體積的微囊懸浮液，用熒光染料染色，稀釋后與甘油混合，滴在載玻片上，并用蓋玻片蓋好，置于熒光顯微鏡下觀察，所用物鏡為100 倍油鏡。BET：采用化學(xué)吸附儀（BET）測(cè)定顆粒的孔徑分布，在吸附測(cè)量之前樣品需在313K進(jìn)行24h脫氣處理，然后在77K測(cè)定氮?dú)馕矫摳降葴鼐€，用BJH法計(jì)算得到孔徑分布圖。FTIR：將凍干后的樣品與KBr混合均勻后壓制成薄片，采用傅立葉變換紅外光譜儀（FTIR）測(cè)定其紅外光譜，掃描范圍450~4000cm1。采用透射法進(jìn)行測(cè)定。FITC標(biāo)記：溶液1：配置4ml 1mg/ml牛血清蛋白的溶液，溶劑為pH 溶液2 ： ml 1mg/ml的FITC，溶劑為二甲基亞砜將溶液1和2混合30~60min，裝入事先煮沸10min的透析袋（殘留分子量為20kDa）中，置于pH ，每隔24h換一次水，最后用蒸餾水透析48h，每隔12h換一次水，以上所有過(guò)程均避光。羅丹明B標(biāo)記：溶液1：配置4ml 1mg/ml牛血清蛋白的溶液，溶劑蒸餾水溶液2：配置1 ml 1mg/ml的羅丹明B，溶劑為甲醇將溶液1和2混合30min~60min，裝入事先煮沸10min的透析袋（殘留分子量為20kDa）中，置于蒸餾水中透析48h，每隔12h換一次水，以上所有過(guò)程均避光。 結(jié)果與討論 不同添加劑對(duì)碳酸鈣分散效果的影響在沒(méi)有任何物質(zhì)加入的情況下，第二次形成的碳酸鈣核的效率很低，可能是由于第一次形成的碳酸鈣核團(tuán)聚在一起所致，因此考慮增加第一次碳酸鈣的分散狀況，用到的方法分為物理法和化學(xué)法，物理法如超聲、化學(xué)法可以加入分散劑。51常用的分散劑有六偏磷酸鈉(SHMP)、多聚磷酸鈉(SPP)、十二烷基磺酸鈉(SDS)、聚羧酸鈉鹽、聚乙二醇[52,53,54]。分散劑能夠促使物料顆粒均勻的分散在介質(zhì)中，形成穩(wěn)定的懸浮體。超聲可以有效地減少納米或微米級(jí)粒子的團(tuán)聚，且在一定的超聲條件下，超聲不會(huì)減少酶的活力，故本文采用超聲方法減少碳酸鈣的團(tuán)聚。時(shí)間為5min。本文選擇了十二烷基磺酸鈉(SDS)、聚羧酸鈉鹽（CMC）、聚乙二醇 6000進(jìn)行了分散研究。其中聚乙二醇 6000被認(rèn)為有利于碳酸鈣球型晶型的形成[54]。在第二次碳酸鈣成核時(shí)，將取約1/4上述帶有雙層(ProtamineSilica)2碳酸鈣核，重新分散于20ml CaCl2溶液中，同時(shí)加入一定量的分散劑，如下表：表23 加入分散劑的種類(lèi)和量1234加入物質(zhì)/SDSCMCPEG 6000加入量，mg/283350加入分散劑后，同時(shí)在增加攪拌轉(zhuǎn)速至1000rpm形成第二次碳酸鈣核，結(jié)果如下圖：圖21 加入不同分散劑的分散效果圖：a) 不加入分散劑；b) 加入SDS；c) 加入CMC；d) 加入PEG 6000由此可見(jiàn)加入的效果大?。篜EG 6000CMCSDS,故以后的實(shí)驗(yàn)中，均選擇PEG 6000作為分散劑。PEG 6000是一種非離子表面活性劑，在它的分子式式H—（—O—CH2—CH2—）n—OH中含有羥基和醚鍵兩種親水基而無(wú)疏水基。當(dāng)加入到溶液中后，其分子鏈一端緊密的吸附于顆粒表面，另一端盡可能伸向溶液中，以減少顆粒之間的吸引力。PEG 6000的加入量對(duì)于分散效果也十分重要。PEG量過(guò)小，則它與顆粒之間的吸附力不足，另一端會(huì)使其吸附在其他顆粒上，使粒子容易沉降，PEG過(guò)多，則伸向溶液中的高分子長(zhǎng)鏈相互纏繞，顆粒也易沉降[55，56]。不同的分散體系加入的分散劑的量也是不同的。由于在第二次碳酸鈣成核過(guò)程中，仍有較多的碳酸鈣并不是在第一次的碳酸鈣核上生成的，所以會(huì)產(chǎn)生4181。m和8181。m左右的兩種碳酸鈣，而前一種并不是本文所要獲得的結(jié)構(gòu)，所以要分離得到的混合物。為了分離4181。m和8181。m左右的兩種碳酸鈣，有以下幾種方法：，根據(jù)資料，2500目的濾布孔徑為5181。m，這兩種濾布理論上都可以用來(lái)分離4181。m和8181。m左右的兩種碳酸鈣。，根據(jù)公式Vg=d2（ρSρL）g/18181。L，ρS=，ρL=1g/cm3，181。L= （20176。C），則4181。m 球狀碳酸鈣Vg=, 8181。m球狀碳酸鈣Vg=,設(shè)假設(shè)在5cm高的燒杯中裝滿(mǎn)水,則分開(kāi)兩種顆粒的時(shí)間為45min。 經(jīng)試驗(yàn)，濾布的分離并不好，因?yàn)闉V布的孔徑并不均一，且容易被碳酸鈣顆粒堵塞，到后期碳酸鈣無(wú)法得到分離。而在簡(jiǎn)單的沉降條件下，分離效果比較良好，如下圖：圖22 超聲后對(duì)于沉降分離的影響a,不超聲直接重力沉降； b,采用超聲后重力沉降法分離故以后所進(jìn)行實(shí)驗(yàn)中均采用超聲5min后進(jìn)行34min的重力沉降。 cell like Shell in shell結(jié)構(gòu)的制備整個(gè)制備過(guò)程如下圖所示：圖23 制備過(guò)程示意圖在制備第一步的碳酸鈣核時(shí)，加入了PSS，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，加入PSS可以調(diào)控碳酸鈣形成的形貌，加入PSS，可產(chǎn)生兩種效果：一是所得晶體粒子的數(shù)量增多，尺寸減小，尺寸和形態(tài)都變得較為均勻，其原因可能是PSS 具有促進(jìn)成核作用，簡(jiǎn)化了成核過(guò)程；二是所得粒子表面變得更加粗糙，具有多孔結(jié)構(gòu)[57]。Ca2+和CO32混合后會(huì)立即成核，生成納米微粒，由于PSS 的存在，這些微粒被穩(wěn)定下來(lái)，進(jìn)一步自發(fā)聚集形成微米尺寸的CaCO3。形成的核如下圖所示：圖24 加入PSS作用下形成的碳酸鈣核：a) SEM照片；b) TEM照片在形成的模板上吸附精蛋白，加入Na2SiO3，可發(fā)生仿生礦化過(guò)程，形成納米結(jié)構(gòu)的氧化硅 [5]，重復(fù)一次以上過(guò)程得到(ProtamineSilica)2雜化微球。利用EDX進(jìn)行元素分析,主要有C、O、S和Si 等元素組成，C、O、S元素的存在證明了精蛋白的存在，Si 來(lái)自于二氧化硅,證明了生物礦化的成功。圖25 ProtamineSilica LbL 雜化微囊的EDX 能譜圖26 ProtamineSilica LbL 雜化微囊的FTIR 譜圖對(duì)除去碳酸鈣核的微囊進(jìn)行FTIR分析，3400cm 1550cm1處的吸收峰來(lái)自于氨基，1190 cm1是S=O的對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)峰，可歸屬于硫酸精蛋白，說(shuō)明精蛋白成功的組裝在微中。一些研究者認(rèn)為870–880 cm?1是Si–O–Si網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的證明 。圖27 精蛋白的氨基酸結(jié)構(gòu)精蛋白結(jié)構(gòu)，硅酸根離子結(jié)構(gòu)，對(duì)出去碳酸鈣核的微囊進(jìn)行FTIR分析，3436 cm1494cm1處的吸收峰來(lái)自于氨基，1184 cm1和1040 cm1是S=O的對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)峰，這些峰都可歸屬于硫酸精蛋白，說(shuō)明精蛋白成功的組裝在微囊中。1090cm1屬于SiOSi吸收峰,一些研究者認(rèn)870–880 cm?1是SiOSi網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的證明[63]。圖28 煅燒后LbL Protamin