【正文】 兩種酶對于偶聯(lián)反應(yīng)的促進(jìn)作用，選擇了另外兩種包埋雙酶的方法，以及直接混合兩種游離酶來比較。結(jié)果如下圖所示：圖36 雙酶在不同方式下催化偶聯(lián)反應(yīng)速率比較：（time是否需要大寫）（1）游離的酶100μl GOx+10μlHRP（2）將兩種酶包埋于shell in shell載體中，100μl （3）將兩種酶分別包埋于兩個載體中混合，100μl GOx載體+50μlHRP載體（4）將兩種酶混合包埋于同一載體中，100μl（這個沒有說明白）由上圖可以看出，游離酶的反應(yīng)速度最快，在約25min后，幾乎將所有底物反應(yīng)完，這是由于游離酶在溶液中能夠與底物充分接觸，底物也沒有擴散限制，所以反應(yīng)較快。而將兩種酶包在兩個載體中，葡萄糖、ABTS的擴散先經(jīng)過一次阻礙，過氧化氫需經(jīng)過兩次阻礙，擴散速度大大降低，在攪拌反應(yīng)80min后，只能達(dá)到游離酶反應(yīng)程度的70%左右；將兩種酶包在同一個載體中，雖然葡萄糖、ABTS的擴散僅需要經(jīng)過一次阻礙，但由于在載體中，兩種酶是隨機的分布的，故第一步反應(yīng)的中間代謝物，也是下一步反應(yīng)的反應(yīng)物—過氧化氫，遇到HRP的幾率也是隨機的，故反應(yīng)速度大大降低，在攪拌反應(yīng)80min后，只能達(dá)到游離酶反應(yīng)程度的60%左右，為幾種反應(yīng)方式中效率最低的；而將酶包埋于shell in shell 載體中，葡萄糖、過氧化氫的擴散僅需要經(jīng)過一次阻礙，ABTS的擴散經(jīng)過兩次阻礙（見圖34），由于shell in shell 的結(jié)構(gòu)特點，過氧化氫產(chǎn)生后，擴散到內(nèi)層，內(nèi)層層壁對對過氧化氫有擴散阻礙作用，但這種作用也在一定程度上起到濃縮過氧化氫的作用，使反應(yīng)較快的進(jìn)行，在攪拌反應(yīng)80min后，能達(dá)到游離酶反應(yīng)程度的80%左右，是三種包埋方式中反應(yīng)效率最高的一種，這在一定程度上證明了這種結(jié)構(gòu)對于生物轉(zhuǎn)化的有效性。需要指出的是，參與反應(yīng)的酶并不完全是包埋在shell in shell 載體，還有部分在單核的載體，故說明shell in shell 載體的有效性應(yīng)高于實驗測得數(shù)據(jù)。 小結(jié) 本章研究了將葡萄糖氧化酶和辣根過氧化酶在shell in shell 載體中的包埋。首先利用BSA研究了載體包埋蛋白率在70%80%左右。測試了游離酶GOx和HRP的反應(yīng)最適溫度；研究了載體反應(yīng)穩(wěn)定性，載體在使用六次后，仍保持65%的活性；比較了同樣條件下，游離的酶GOx和HRP、將兩種酶包埋于shell in shell載體中、將兩種酶分別包埋于兩個載體中混合、將兩種酶混合包埋于同一載體中的反應(yīng)速度比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)將兩種酶包在shell in shell載體中比另外兩種包埋多酶的方式活性更高。第四章 結(jié)論與展望結(jié)論：（1）研究了celllike shell in shell 載體的制備過程，并對制備的載體進(jìn)行了表征。實驗證明，在CaCl2溶液中加入PSS，可以調(diào)控形成碳酸鈣的形貌，得到均一的約4181。m大小的模板，在模板上吸附精蛋白，可以誘導(dǎo)硅酸鈉形成納米顆粒的氧化硅。若交替吸附兩次精蛋白和硅酸鈉，則去核后形成的微囊孔徑為9nm左右，若交替吸附三次。在第二次成核過程中，在CaCl2溶液中加入PEG6000約50mg，能夠使碳酸鈣得到很好的分散，超聲5min后重力沉降約34min，可以除去大部分4181。m碳酸鈣，獲得8181。m碳酸鈣。（2）研究了將葡萄糖氧化酶和辣根過氧化酶在shell in shell 載體中的包埋。首先利用BSA研究了載體包埋蛋白率在70%80%左右。測試了游離酶GOx和HRP的反應(yīng)最適溫度；研究了載體反應(yīng)穩(wěn)定性，載體在使用六次后，仍保持65%的活性；比較了同樣條件下，游離的酶GOx和HRP、將兩種酶包埋于shell in shell載體中、將兩種酶分別包埋于兩個載體中混合、將兩種酶混合包埋于同一載體中的反應(yīng)速度比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)將兩種酶包在shell in shell載體中比另外兩種包埋多酶的方式活性更高。展望：固定化酶的諸多優(yōu)勢，促使固定化技術(shù)的發(fā)展，固定化多酶提出了許多挑戰(zhàn)，如何更好固定化多酶，本文只是提供了一種方法。本研究中，采用的碳酸鈣作為模板，然而，在研究過程中發(fā)現(xiàn)，第二次形成的雙層結(jié)構(gòu)的效率并不高，如何解決這一問題應(yīng)該是非常重要的。本研究所形成的固定化酶的載體在8μm左右，還是沒有達(dá)到納米尺度。由于時間有限，并未對固定化雙酶的最適pH、反應(yīng)動力學(xué)進(jìn)行考察。本研究中選用的兩種酶是研究雙酶系統(tǒng)的模型酶，在以后的研究中可以換用另外的體系。Shell in shell 載體包埋不同的酶，有望在生物傳感、生物轉(zhuǎn)化、藥物傳遞、廢水處理等領(lǐng)域發(fā)揮作用。參考文獻(xiàn)[1]酶工程．陳守文．科學(xué)出版社[M]．2008，1—200．[2]Roger A，Sheldon．Enzyme immobilization：the quest for optimum performance[J]．Adv. Synth. Catal，2007，349：1289 – 1307．[3]Dean Brady，Justin Jordaan．Advances in enzyme immobilization[J]．Biotechnol Lett，2009 31：1639–1650．[4]姜艷軍．基于仿生鈦化和自組裝的酶固定化載體設(shè)計與制備[D]．天津：天津大學(xué)，2009．[5]孫倩蕓．仿生硅化與自組裝固定化酶用于二氧化碳轉(zhuǎn)化的研究[D]．天津：天津大學(xué)，2009．[6]Mann S. Biomineralization：Principles and concepts in bioinorganic materials　chemistry[D]．New York：Oxford University Press，2001．[7]付永昌，劉 強．基于生物礦化的仿生合成技術(shù)及其應(yīng)用[J]．材料導(dǎo)報，2008：12（22）：272275．[8]Sun Q，Van Santen R et al. Bioinspired synthesis of mesoporous silicas[J]．Curr．Opin. Solid.，2004, 8(2) ：111 —120．[9]Hildebrand M， Doktycz M J，Allison D P． Application of AFM in understanding biomineral formation in diatoms[J]． Eur. J. Physiol.，2008，456：127 —137．[10]Zhou Y et al．Efficient catalysis of　polysiloxane synthesis by silicatein α requires specific hydroxyl and imidazole functionalities[J]． Angew. Chem. Int. Ed.， 1999， 38(6) ：779 —782．[11]Kr246。ger N, Deutzmann R, Sumper M． Polycationic peptides from diatom biosilica that direct silica nanosphere formation[J]. Science，1999， 286(5442)：1129 —1132．[12]Betancor L， Luckarift H．Bioinspired enzyme encapsulation for biocatalysis[J]．Trends in Biotechnology．2008，26(10) ： 566572．[13]Luckarift H R， Spain J C，Naik R et al．Enzyme immobilization in a biomimetic silica support[J]． Nature Biotechnology，2004，22(2) ：211213．[14]Sewell S L，Rutledge R D，Wright D W．Versatile biomimetic dendrimer templates used in the formation of TiO2 and GeO2[J] ．Dalton Trans. ，2008 ：3857 —3865．[15]Decher C, Hong J D．Buildup of ultrathin multilayer films by a selfassembly process： Consecutive adsorption of anionic and cationic bipolar amphiphiles on charged surfaces[J] ． . ，1991 ，46 ：321 —327．[16]Ariga K, Hill J P, Ji Q．Layerbylayer assembly as a versatile bottomup nanofabrication technique for exploratory research and realistic application[J]．. Chem. Phys., 2007， 9： 2319—2340．[17]Bedau， M. A. et al． Open problems in artificial life[J]． Artif. Life，2000 ，6 ：363 —376．[18]Deamer, D．A giant step towards artificial life[J]? Trends Biotechnol，2005，23 ：336 —338．[19]Rasmussen　et al． Evolution：transitions from nonliving to living　matter[J] ．Science ，2004 ，303 ：963 —965．[20]Glass, J. I. et al． Essential genes of a minimal bacterium[J]．Proc. Natl Acad. Sci. ，2006 ，103 ：425 —430．[21]Lartigue， C. et al．Genome transplantation in bacteria: changing one species to another[J]．Science，2007 ，317 ：632 —638．[22]Noireaux, V. ，Libchaber A． A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly[J]． Proc. Natl Acad. Sci. ，2004 ，101： 17669—17674．[23]Monnard, P. A. ，Luptak, A. ，Deamer, D. W. Models of primitive cellular life: polymerases and templates in liposomes[J]．Phil. Trans. R. Soc. B，2007 ，362：1741—1750．[24]Mansy S. et al．Templatedirected synthesis of a genetic polymer in a model protocell[J]．Nature ，2008 ，454 ：122 —125．[25]Murtas, G., et al． Protein synthesis in liposomes with a minimal set of enzymes[J] ．Biochem. Biophys．Res. Commun，2007，363：12—17．[26] Paul M. Gardner et al． Sugar synthesis in a protocellular model leads to a cell signalling response in bacteria[J]．Nature Chemistry，2009 ，8(1) ：377—383．[27]Ying Zhang et al．Artificial cells：building bioinspired systems using smallscale biology[J]．Trends in Biotechnology，2007，26 (1) ：16 —20．[28]philip r. leduc et al．Towards an in vivo biologically inspired nanofactory[J]．Nature Nanotechnology， 2007，1(2) ：1—6．[29]Rene233。 Roodbeen ，Jan C. M. van Hest．Synthetic cells and organelles：partmentalization strategies[J]．BioEssays．2009，31(1) ：299 —1308．[30]Brigitte St228。dler et al. Polymer hydrogel capsules: en route toward synthetic cellular systems[J]. Nanoscale，2009 ，1 ，68 —73．[31]Peter Walde． Building artificial cells and protocell models：experimental approaches with lipid vesicles[J]． BioEssays，2010 ，32：296 —303．[32]Forster AC， Church GM．Towards synthesis of a minimal cell[J]．Mol Syst Bio， 200