【正文】
ger N, Deutzmann R, Sumper M. Polycationic peptides from diatom biosilica that direct silica nanosphere formation[J]. Science,1999, 286(5442):1129 —1132.[12]Betancor L, Luckarift H.Bioinspired enzyme encapsulation for biocatalysis[J].Trends in Biotechnology.2008,26(10) : 566572.[13]Luckarift H R, Spain J C,Naik R et al.Enzyme immobilization in a biomimetic silica support[J]. Nature Biotechnology,2004,22(2) :211213.[14]Sewell S L,Rutledge R D,Wright D W.Versatile biomimetic dendrimer templates used in the formation of TiO2 and GeO2[J] .Dalton Trans. ,2008 :3857 —3865.[15]Decher C, Hong J D.Buildup of ultrathin multilayer films by a selfassembly process: Consecutive adsorption of anionic and cationic bipolar amphiphiles on charged surfaces[J] . . ,1991 ,46 :321 —327.[16]Ariga K, Hill J P, Ji Q.Layerbylayer assembly as a versatile bottomup nanofabrication technique for exploratory research and realistic application[J].. Chem. Phys., 2007, 9: 2319—2340.[17]Bedau, M. A. et al. Open problems in artificial life[J]. Artif. Life,2000 ,6 :363 —376.[18]Deamer, D.A giant step towards artificial life[J]? Trends Biotechnol,2005,23 :336 —338.[19]Rasmussen et al. Evolution:transitions from nonliving to living matter[J] .Science ,2004 ,303 :963 —965.[20]Glass, J. I. et al. Essential genes of a minimal bacterium[J].Proc. Natl Acad. Sci. ,2006 ,103 :425 —430.[21]Lartigue, C. et al.Genome transplantation in bacteria: changing one species to another[J].Science,2007 ,317 :632 —638.[22]Noireaux, V. ,Libchaber A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly[J]. Proc. Natl Acad. Sci. ,2004 ,101: 17669—17674.[23]Monnard, P. A. ,Luptak, A. ,Deamer, D. W. Models of primitive cellular life: polymerases and templates in liposomes[J].Phil. Trans. R. Soc. B,2007 ,362:1741—1750.[24]Mansy S. et al.Templatedirected synthesis of a genetic polymer in a model protocell[J].Nature ,2008 ,454 :122 —125.[25]Murtas, G., et al. Protein synthesis in liposomes with a minimal set of enzymes[J] .Biochem. Biophys.Res. Commun,2007,363:12—17.[26] Paul M. Gardner et al. Sugar synthesis in a protocellular model leads to a cell signalling response in bacteria[J].Nature Chemistry,2009 ,8(1) :377—383.[27]Ying Zhang et al.Artificial cells:building bioinspired systems using smallscale biology[J].Trends in Biotechnology,2007,26 (1) :16 —20.[28]philip r. leduc et al.Towards an in vivo biologically inspired nanofactory[J].Nature Nanotechnology, 2007,1(2) :1—6.[29]Rene233。由于時間有限,并未對固定化雙酶的最適pH、反應(yīng)動力學(xué)進行考察。測試了游離酶GOx和HRP的反應(yīng)最適溫度;研究了載體反應(yīng)穩(wěn)定性,載體在使用六次后,仍保持65%的活性;比較了同樣條件下,游離的酶GOx和HRP、將兩種酶包埋于shell in shell載體中、將兩種酶分別包埋于兩個載體中混合、將兩種酶混合包埋于同一載體中的反應(yīng)速度比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)將兩種酶包在shell in shell載體中比另外兩種包埋多酶的方式活性更高。m碳酸鈣,獲得8181。實驗證明,在CaCl2溶液中加入PSS,可以調(diào)控形成碳酸鈣的形貌,得到均一的約4181。 小結(jié) 本章研究了將葡萄糖氧化酶和辣根過氧化酶在shell in shell 載體中的包埋。 三種微囊固定化酶活的比較為了考察shell in shell 結(jié)構(gòu)包埋兩種酶對于偶聯(lián)反應(yīng)的促進作用,選擇了另外兩種包埋雙酶的方法,以及直接混合兩種游離酶來比較。C左右。溫度,176。C、 50176。,控制溫度分別在5176。C的活性。C 、30176。參比溶液為:pH ,1ml %ABTS。ABTS :% 磷酸緩沖液: Na2HPO4和 NaH2PO4 配置根據(jù)以上反應(yīng)完成酶活力的檢測:在5ml小燒杯中加入緩沖液1390μl ,過氧化氫 100μl,ABTS 500μl,攪拌,加入酶溶液10μl ( u),一定時間后,在紫外分光光度計405nm處測吸光值。+在405nm下吸光值來判斷反應(yīng)的ABTS的量。(1 mol/L)[S]Km (30110 mM)1 mol/L NaOH1 mol/L HCl酚酞 : 酚酞溶于10ml 60%90%乙醇中測定方法:取250ml三角燒瓶,加入葡萄糖溶液5ml(含1g 5mmol), ml,(約30 u)立即攪拌反應(yīng)30min,加入5ml NaOH(5 mmol)終止反應(yīng),用HCl滴定過量堿,記錄消耗的鹽酸體積V1,ml對照實驗:在加入酶液前加入NaOH,記錄消耗的鹽酸體積V2,ml,約(5 ml)每min鐘催化葡萄糖氧化生成1μmol葡萄糖酸的酶量定義為1個酶活單位。取約1/4 ,置于20mLCaCl2溶液,加入60mg PSS 粉末和4mg GOx,50mg PEG6000,在1000rpm的轉(zhuǎn)速下攪拌5min,將20ml Na2CO3迅速加入,攪拌20s,靜置20min,用水洗滌三次。層層組裝(ProtamineSilica)3后,EDTA去核30min,35次后用水洗滌2次,得到GOx或HRP的(ProtamineSilica)3雜化微囊。g BSA,比吸附法固定的蛋白質(zhì)1520ug 多,故選擇共沉淀方法固定酶。辣根過氧化酶常常被固定用于過氧化氫的生物傳感器,也被用來處理含有酚的廢水。, 分子量為44 kDa,來自于植物辣根中,一個酶分子包括肽鏈(33890 Da)、血紅素、Ca2+(700 Da),碳水化合物(9400 Da),至少有七中異構(gòu)體。這種酶能夠氧化D己醛糖, D葡萄糖, ,在pH 47之間都有一定活性。m碳酸鈣。m大小的模板,在模板上吸附精蛋白,可以誘導(dǎo)硅酸鈉形成納米顆粒的氧化硅。m碳酸鈣微球為了使酶分子能夠有自由的活動空間,最后要將模板碳酸鈣去除,要選擇一種溫和的去除方式,不能破壞酶的結(jié)構(gòu),使酶活力下降,根據(jù)文獻,176。該類型的吸附等溫線表明了氧化硅材料介孔尺寸分布窄,孔連通性好,圖中的孔分布曲線也進一步證明微囊的孔徑多集中在9nm 左右。1090cm1屬于SiOSi吸收峰,一些研究者認870–880 cm?1是SiOSi網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的證明[63]。利用EDX進行元素分析,主要有C、O、S和Si 等元素組成,C、O、S元素的存在證明了精蛋白的存在,Si 來自于二氧化硅,證明了生物礦化的成功。而在簡單的沉降條件下,分離效果比較良好,如下圖:圖22 超聲后對于沉降分離的影響a,不超聲直接重力沉降; b,采用超聲后重力沉降法分離故以后所進行實驗中均采用超聲5min后進行34min的重力沉降。C),則4181。m左右的兩種碳酸鈣。m和8181。由于在第二次碳酸鈣成核過程中,仍有較多的碳酸鈣并不是在第一次的碳酸鈣核上生成的,所以會產(chǎn)生4181。當(dāng)加入到溶液中后,其分子鏈一端緊密的吸附于顆粒表面,另一端盡可能伸向溶液中,以減少顆粒之間的吸引力。本文選擇了十二烷基磺酸鈉(SDS)、聚羧酸鈉鹽(CMC)、聚乙二醇 6000進行了分散研究。51常用的分散劑有六偏磷酸鈉(SHMP)、多聚磷酸鈉(SPP)、十二烷基磺酸鈉(SDS)、聚羧酸鈉鹽、聚乙二醇[52,53,54]。采用透射法進行測定。TEM:將將微囊或微粒的懸浮液稀釋后滴在銅網(wǎng)上,在掃描隧道顯微鏡下觀察。以上過程重復(fù)35 次,以徹底除去碳酸鈣,去核后得微囊,以水洗滌三次,水中貯存?zhèn)溆谩?共沉淀制備碳酸鈣覆蓋(ProtamineSilica)2球中球結(jié)構(gòu)取約1/4上述帶有雙層(ProtamineSilica)2碳酸鈣核,重新分散于20ml CaCl2溶液中,加入60mg PSS以及 50mg PEG6000,在1000rpm的轉(zhuǎn)速下攪拌5min,將20ml Na2CO3迅速加入,攪拌20s,靜置20min。取一定量CaCO3 (PSS)微粒置于離心管中(粒子濃度約為1% w/w),用水洗滌兩次,每次洗滌后3000rpm離心3min以除去上清液。取20mL CaCl2溶液,加入60mg PSS粉末,使其完全溶解。根據(jù)國內(nèi)外的研究進展,結(jié)合課題組的優(yōu)勢,欲利用生物仿生硅化的層層組裝方法來制造一種shell in shell 的結(jié)構(gòu),并且利用這種結(jié)構(gòu)包埋具有串聯(lián)作用的兩種酶,進而檢測這種結(jié)構(gòu)在包埋多酶系統(tǒng)上的效果。姜艷軍采用仿生鈦化過程構(gòu)建AlgProTi 雜化微囊作為多酶微工廠“廠房,以LbL 微囊作為工作車間,實現(xiàn)了多酶體系內(nèi)部的功能分割,便于單獨調(diào)節(jié)每種酶的催化特性可將不同酶種分別固定在LbL 微囊,shellsinShell結(jié)構(gòu)多酶微工廠中,囊壁孔徑分布主要集中在2~8nm,既能保證酶分子不泄漏,又能保證底物和產(chǎn)物分子的自由進出。Oliver Kreft等人利用碳酸鈣作為模板,采用類似的方法,制造出了shell in shell的結(jié)構(gòu),由于碳酸鈣的制作和最后去除模板的方法都十分溫和,對酶的活性影響不大,因此這種方法很適合包埋酶。在工業(yè)應(yīng)用中,生物轉(zhuǎn)化往往也需要多種酶的共同協(xié)同作用生產(chǎn)某種產(chǎn)品。K. S. Atia等人共固定用于生物催化,將β淀粉酶和麥芽糖酶包埋用于淀粉的糖化[40]。最常用的方法是將兩種或三種酶按照一定的比例混合到同一載體中。 混合固定化酶是將單酶分別固定到不同載體上在同一反應(yīng)體系重新混合。在工業(yè)應(yīng)用中,生物轉(zhuǎn)化往往也需要多種酶的共同協(xié)同作用生產(chǎn)某種產(chǎn)品。人工細胞同生物之間的信息交流應(yīng)該分為兩類:一類是人工細胞發(fā)出信息,得到生物的響應(yīng),如在人工細胞中合成一種糖類,能夠引起海洋菌Vibrio harvei的群體效應(yīng),產(chǎn)生熒光現(xiàn)象[29 ]。近些年來,化學(xué)家和生物學(xué)家利用各自的方法創(chuàng)造著不同的人工細胞,但要真正達到細胞所具有的自我復(fù)制性、膜的選擇透過性、識別性能、自我修復(fù)和進化,還是具有很長的路。以硅為模板,層層組裝形成外膜后去除模板,得到含有DNA和核酸內(nèi)切酶的微囊,加入二價陽離子后,DNA被降解[34]。Bottomup一般是化學(xué)家所采用的方法,合成細胞外殼的物質(zhì)和方法通常有脂質(zhì)體、聚合物polymersomes、乳液法形成的外殼、層層組裝法形成的外殼。圖15 GOD和CAT酶的偶聯(lián)反應(yīng)提高微囊壁滲透性釋放胰島素的示意圖[50]Qi等以胰島素粒子為模板,交替吸附一定層數(shù)的葡萄糖氧化酶GOD和過氧化氫酶CAT,以戊二醛進行交聯(lián),當(dāng)粒子接觸到葡糖糖后,葡糖糖被GOD氧化生成葡糖糖酸,pH下降,使得粒子的膜層微環(huán)境改變,通透性增加,粒子內(nèi)的胰島素逐漸的釋放[50]。多糖類如海藻酸鈉、殼聚糖、羧甲基纖維素、硫酸葡聚糖,多肽如精蛋白、聚賴氨酸和聚谷氨酸等都已成功用于LbL自組裝微囊的制備。m38形狀球球球discocyte多孔