【文章內(nèi)容簡介】 中，高壓滅菌20 min，然后冷卻至室溫，再加入50 mL 10YNB、1 mL 500B、50 mL 10M、50 mL 1 mol/L K3PO4（pH ），最后4 ℃ 保存?zhèn)溆?。?）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳溶液的配制①30 % 凝膠儲(chǔ)液： g Acr， g Bis，加100 mL蒸餾水溶解。②分離膠緩沖液： g Tris，48 mL 1 mol/L HCl，加100 mL蒸餾水溶解。③濃縮膠緩沖液： g Tris，48 mL 1 mol/L HCl，加100 mL蒸餾水溶解。④電極緩沖液： g SDS，9 g Tris， g甘氨酸，加1500 mL蒸餾水溶解。⑤1 mol/L、pH TrisHCl緩沖液： g Tris，加800 mL蒸餾水溶解，再加70 mL 1 mol/L HCl，最后加蒸餾水定容至1000 mL。⑥樣品緩沖液：取1 mL TrisHCl緩沖液， g SDS， g溴酚藍(lán)，2 mL甘油， mL β巰基乙醇，加10 mL 蒸餾水溶解。⑦10 % 過硫酸銨：稱取1 g過硫酸銨，加10 mL 蒸餾水溶解（現(xiàn)用現(xiàn)配）。⑧固定液：取45 mL 95%乙醇，10 mL 冰醋酸，加100 mL 蒸餾水。⑨染色液： g考馬斯亮藍(lán)R250，加入135 mL 95%乙醇，30 mL冰醋酸，加300 mL 蒸餾水，混勻，用濾紙過濾。⑩脫色液：取70 mL 冰醋酸，200 mL 乙醇，加1000 mL 蒸餾水。（4）膠體幾丁質(zhì)的制備①稱取10 g片狀幾丁質(zhì)（剪碎）置于500 mL三角瓶中，加100 mL濃鹽酸浸泡，然后放入37 ℃ 搖床中至幾丁質(zhì)完全溶解，4 ℃ 過夜。②向溶液中加入500 mL 50 % 乙醇，不斷攪拌至析出膠體，然后5000 r/min離心5 min，棄掉上清液。③在膠體中再加蒸餾水，攪拌后5000 r/min離心5 min。（5）DNS的制備① g DNS，加500 mL水，45 ℃ 水浴溶解。②逐步加入NaOH溶液（20 g 溶于水），不斷攪拌至溶液清澈透明。③然后加入91 g酒石酸鉀鈉， g無水亞硫酸鈉。④45 ℃ 水浴，同時(shí)加水不斷攪拌至全溶。⑤停止加熱，冷卻至室溫，用水定容至1000 mL 。⑥將液體儲(chǔ)存于棕色瓶，避光保存7 d， 備用。（6）廣泛pH緩沖液 g檸檬酸 、 g磷酸二氫鉀 、 g硼酸 、 g巴比妥，加1 L 蒸餾水溶解。 主要儀器設(shè)備Anke DL5B低速大容量離心機(jī)，Anke TGL16C高速臺(tái)式離心機(jī)，恒溫水浴鍋，雙層全溫?fù)u床（上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），UV2000紫外可見分光光度計(jì)，DYY12型電腦三恒多用電泳儀、WD9412A型恒溫循環(huán)器、WD9405A型脫色搖床（北京市六一儀器廠），夾心式垂直板電泳槽。 實(shí)驗(yàn)方法 酵母工程菌的培養(yǎng)和幾丁質(zhì)酶的誘導(dǎo)分泌表達(dá)（1）挑取GStachit1K單菌落，接種到含25 mL BMGY培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，用紗布封口，放到搖床中，28 ℃、130 r/min 振蕩培養(yǎng)3 d至對(duì)數(shù)生長期（OD600為26）。（2）將BMGY培養(yǎng)物以5000 r/min離心1015 min，回收酵母細(xì)胞，棄掉上清液，將細(xì)胞重懸于BMMY培養(yǎng)基中，（約100~200 ml）。（3）將培養(yǎng)液置于500 mL搖瓶中，用雙層紗布封口，在搖床中2830 ℃繼續(xù)培養(yǎng)并開始誘導(dǎo)表達(dá)（注意溫度不要超過30 ℃）。（4）誘導(dǎo)開始后，每天補(bǔ)加100 % %。（5）誘導(dǎo)開始后，每天取樣一次，直至第7天。每次取樣3 mL離心管中20 ℃ 保存。樣品用于制作產(chǎn)酶曲線和蛋白電泳。 N乙酰氨基葡萄糖（NAG）標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立表1 NAG濃度的配制Tab. 1 Standard curve of NAG項(xiàng)目01 2 3 4 5 6 7 8 9 10 NAG標(biāo)準(zhǔn)液（mL） NAG的量（mg） 蒸餾水（mL） DNS（mL） ①配制1 g/mL N乙酰氨基葡萄糖（NAG）溶液。②取11支25 mL按(表1)加入試劑，將各管混勻，沸水浴煮沸10 min。③取出后立即用冷水冷卻至室溫，再向每試管加入3 mL蒸餾水，混勻。④測540 nm處的吸光值，以蒸餾水為空白調(diào)零，每組3個(gè)重復(fù)。⑤以NAG濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。 酵母工程菌產(chǎn)酶曲線的測定將保存的粗酶液樣品取出，幾丁質(zhì)酶活性測定參照Antoni和Masarus方法[6,7]，并加以改進(jìn)。1 mL 酶液放于50 ℃水浴保溫1 h，上清液中的還原糖采用DNS法測定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出還原糖的含量，然后計(jì)算酶活。酶活性單位（U）定義為：每分鐘水解幾丁質(zhì)產(chǎn)生1 mg還原糖所需的酶蛋白量[8]。 幾丁質(zhì)酶的分離純化 粗酶液的制備根據(jù)分析最佳收獲時(shí)間為7 d。第7天終止發(fā)酵收集發(fā)酵液。將發(fā)酵液5000 r/min離心1015 min，收集上清液即為粗酶液。 硫酸銨沉淀向提取的粗酶液中加入固體硫酸銨至80%飽和度，冰浴后過夜。以5000 r/min離心15 min，收集沉淀。用適量50 mmol/mL pH TrisHCl緩沖液溶解，并在相同緩沖液中透析23 d，取少量溶液加BaCl2檢測是否透析完全。透析完全后，將透析液以5000 r/min離心15 min，取上清液，80℃保存。 幾丁質(zhì)酶的SDSPAGE檢測對(duì)純化酶液和17 d的粗酶液進(jìn)行SDSPAGE，測定表觀幾丁質(zhì)酶的分子量。（1）分離膠凝膠液與濃縮膠凝膠液的配制①12 %分離膠凝膠液： mL 30 % 凝膠儲(chǔ)液， mL分離膠緩沖液， mL 10 % SDS， mL ddH2O，30 μl 10 % 過硫酸銨，30 μl TEMED，混勻。②3 % 濃縮膠凝膠液： mL 30 % 凝膠儲(chǔ)液， mL濃縮膠緩沖液， μl 10 % SDS， mL ddH2O，15 μL 10 % 過硫酸銨，10 μL TEMED，混勻（現(xiàn)配現(xiàn)用）。（2）電泳操作[9]①按照順序安裝玻璃板，然后沿兩板縫隙加入15 % 融化的瓊脂，待瓊脂凝固后加入現(xiàn)配的12 % 分離膠凝膠液，至膠面距低板邊緣3 cm左右，然后用滴管在膠面上輕輕鋪?zhàn)? cm水層，垂直放置膠板，室溫下放置30 min待膠凝聚。凝聚后用濾紙吸出膠面上的水。②將3 % 濃縮膠凝膠液迅速注入分離膠上層，使液面與低板邊緣齊平，插入梳子。室溫下放置2 h，待其完全凝聚。凝聚后小心拔出梳子，在玻璃板兩側(cè)倒入電極緩沖液。③將17 d的粗酶液離心，取50 μL上清再加入50 μL上樣緩沖液，對(duì)照組用提純的酶液。混勻后在沸水中煮10 min，冷卻后用微量加樣器將25 μL樣品和低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分別注入加樣孔中。④將電泳槽與電泳儀相連，電壓保持100 V進(jìn)行電泳，至樣品遷移至玻璃板下端1 cm時(shí)停止電泳。（3）染色及脫色①將電泳完畢的凝膠取出，用去離子水沖洗，然后放到考馬斯亮藍(lán)R250染色液中染色，過夜。②棄去染色液，凝膠沖洗后置于固定液中固定。③將凝膠置于500 mL脫色液中脫色，至膠脫色完全。④脫色后，將膠板置于去離子水中室溫下保存。（4） 分子量測定已知標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白質(zhì)（低）各電泳條帶的分子量，通過電泳圖估計(jì)幾丁質(zhì)酶的分子量[10]。 幾丁質(zhì)酶的酶學(xué)性質(zhì) 幾丁質(zhì)酶反應(yīng)的最適溫度將酶反應(yīng)體系分別置于30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃、75 ℃和80 ℃下反應(yīng)1 h，DNS法檢測幾丁質(zhì)酶的活性，確定酶反應(yīng)的最適溫度。最高的酶活力定義為100％，分別計(jì)算不同溫度條件下幾丁質(zhì)酶的相對(duì)酶活性（即在不同溫度下的酶活性占最高酶活性的百分比）。 幾丁質(zhì)酶反應(yīng)的最適pH值、、、、。將最高的酶活力定義為100 ％，分別計(jì)算不同pH值條件下幾丁質(zhì)酶的相對(duì)酶活性（方法同上）。 幾丁質(zhì)酶的熱穩(wěn)定性先將酶液分別置于30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃和55 ℃下保溫不同的時(shí)間（10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60min）后，立即在0 ℃冰浴中冷卻，然后加入幾丁質(zhì)在50 ℃反應(yīng)1 h ，測定幾丁質(zhì)酶活性，以剩余的酶活性作為酶的熱穩(wěn)定性的指標(biāo)。將最高的酶活力定義為100％，分別計(jì)算不同溫度條件下幾丁質(zhì)酶的相對(duì)酶活性。 幾丁質(zhì)酶的pH值穩(wěn)定性將酶液分別在pH 、、、 h后，測定剩余的酶活性。將最高的酶活力定義為100％，分別計(jì)算不同pH值條件下幾丁質(zhì)酶的相對(duì)酶活性。 不同金屬離子對(duì)酶活性的影響在幾丁質(zhì)酶反應(yīng)體系中加入不同的金屬離子（Cu2+、Ca2+、Mn2+、Fe2+、Zn2+、Ba2+、K+、Na+、Ag+、Mg2+、NH4+ 、Hg+） mol/L，在50 ℃下反應(yīng)1 h后，以反應(yīng)體系中不加金屬離子的酶活性為100％，分別測定加入不同金屬離子后反應(yīng)體系中幾丁質(zhì)酶的相對(duì)酶活性。 變性劑、蛋白抑制劑和有機(jī)溶劑對(duì)酶活性的影響在幾丁質(zhì)酶反