【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 日本島津制作天平所 磁力加熱攪拌器 781 江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠 電熱恒溫水浴鍋 HHS 北京中興偉業(yè)儀器有限公司 精密 PH 計(jì) PHS3C 型 上海精密科學(xué)儀器有限公司雷磁儀器廠 電熱鼓風(fēng)干燥箱 101 型 北京市永光明醫(yī)療儀器廠 恒溫振蕩器 CHAS 金壇市華峰儀器有限公司 離心機(jī) LDA2 北京醫(yī)用離心機(jī)廠 高速切乳化機(jī) FA25 上海弗魯克液體機(jī)械制造有限公司 畢業(yè)論文 8 實(shí)驗(yàn)方法 基本組成成分的測(cè)定 水分含量的測(cè)定 :按 GB —2020 直接干燥法測(cè)定 灰分含量的測(cè)定 :按 GB —2020 灼燒稱重法測(cè)定 粗脂肪含量的測(cè)定 :按 GB 索氏抽提法測(cè)定 粗蛋白含量的測(cè)定 :按 GB —2020 凱氏定氮法測(cè)定 緩沖溶液的配制如下： 表一 磷酸氫二鈉 磷酸二氫鉀緩沖液（ 1/15mol/L）的配制 pH 1/15mol/L Na2HPO4 1/15mol/LKH2PO4 0 1/15mol/LNa2 HPO4 的 配 置 ： 取 Na2HPO412H2O 溶 于 蒸 餾 水 后 定 容 至 1000mL ；Na2HPO412H2O 分子量 =。 1/15mol/LKH2PO4的配置：取 KH2PO4溶于蒸餾水后定容至 1000mL； KH2PO4 分子量=。 豌豆蛋白的基本成分組成 表二 豌豆蛋白粉的基本成分組成及含量（ %） 總蛋白 粗脂肪 水分 灰分 氮溶指數(shù) 堿性蛋白酶酶解豌豆蛋白粉 采用堿性蛋白酶 (Alcalase) 對(duì)豌豆蛋白進(jìn)行酶解 ， 準(zhǔn)確稱取一定量的豌豆蛋白粉堿性蛋白酶改性豌豆蛋白 的起泡性能研究 9 于錐形瓶中，加入一定 pH 的緩沖溶液，放入事先調(diào)好溫度的恒溫振蕩箱中振蕩溶解20min；按一定的酶與底物質(zhì)量之比（ E/S）添加酶，在恒溫振蕩器中酶解一定時(shí)間；將錐形瓶置于沸水中滅酶 10 min，自來(lái)水冷卻；定容，離心 (4000 r/min， 10 min)，取上清液 待用。 起泡性的測(cè)定 用移液管量取上清液 20mL于 100mL小燒杯中，用高速切乳化機(jī)以 10000r/min的速度 攪打 2min后立即轉(zhuǎn)入量筒中，分別 記錄 0min時(shí)和 30min后 的泡沫體積 V1和 V2，按下式計(jì)算 : 起泡 能力 =均質(zhì)停止時(shí)泡沫體積 (V1)/攪打前液體體積 100% 泡沫穩(wěn)定性 =均質(zhì)停止后 30min 泡沫體積 (V2)/均質(zhì)停止時(shí)泡沫體積 (V1) 100% 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用堿 性蛋白酶水解 豌豆 蛋白， 探討 加酶量、酶作用時(shí)間、底物濃度、酶作用溫度、 pH 對(duì) 豌豆蛋白 起泡能力及泡沫穩(wěn)定性 的影響。 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法 (response surface methodology， RSM)中的 BoxBehnken 軟件 對(duì)水解條件進(jìn)行優(yōu)化， 進(jìn)一步研究各個(gè)因素及其交互作用對(duì)豌豆蛋白 起泡能力及泡沫穩(wěn)定性 的影響 ， 建立 響應(yīng)面模型的回歸方程并對(duì) 每一個(gè)系數(shù) 的 顯著性 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析 。 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論 單因素結(jié)果與分析 加酶量 E/S(W/W) 底物濃度 4%， 30min， 50℃， 的前提下， 采用 %， %， %， %，%， %的酶濃度 ， 在 底物濃度、酶解溫度、 pH 值等其它因素不變的情況下，增大堿性蛋白酶用量增加，豌豆?jié)饪s蛋白的起泡能力及起泡的穩(wěn)定性逐漸增加， 當(dāng)加酶量達(dá)到 %時(shí)， 起泡性與泡沫穩(wěn)定性達(dá)到最大值， 隨后 開(kāi)始慢慢減小。這可能是 畢業(yè)論文 10 由于有限酶的催化水解使蛋白質(zhì)分子柔性增加，疏水 基團(tuán)充分暴露，因而使蛋白質(zhì)分子能迅速吸附至氣 — 水界面，并隨即將界面張力下降至低水平能力，增強(qiáng)了起泡性。然而，由于低分子質(zhì)量肽不能在界面形成具有黏附性質(zhì)的膜，因而過(guò)度的水解會(huì)損害起泡能力 ，當(dāng)酶用量達(dá)到一定程度后，由 于底物濃度不能對(duì)酶達(dá)到飽和，導(dǎo)致酶的作用受到抑制，酶用量的增加不能再提高起泡性 。 如圖 1 所示 ， 100150200250300% % % % % %加酶量起泡能力/mL010203040泡沫穩(wěn)定性/minFAIFSI 圖一 加酶量對(duì)起泡性與泡沫穩(wěn)定性的影響 底物濃度 采用 2%， 4%， 6%， 8%， 10%的底物濃度， 豌豆蛋白在酶濃度、酶解時(shí)間、酶解溫度、pH 值不變的條件下，在較低底物濃度時(shí)，隨著底物濃度增加，起泡性和起泡穩(wěn)定性逐漸增大。這可能因?yàn)殡S著底物濃度的增加，使蛋白液表面的濃度提高，從而增加了親水基團(tuán)和疏水的非極性基團(tuán)，增大了蛋白酶與底物蛋白分子肽鍵的接觸機(jī)會(huì)，使得氣泡易于形成，提高了蛋白質(zhì)的起泡性。 當(dāng)?shù)孜餄舛?增加 達(dá)到 8%時(shí)，起泡性與泡沫穩(wěn)定性達(dá)到最大值， 隨后 當(dāng)?shù)孜餄舛?繼續(xù) 增大 時(shí) ，起泡能力開(kāi)始呈現(xiàn)下降趨勢(shì) ，這可能是因?yàn)榈孜餄舛容^大時(shí)，在不斷受熱的情況下，小分子進(jìn)一步聚合形成可溶性的聚合多肽，界面張力增加，起泡性逐漸減小 。 如圖 二 所示 堿性蛋白酶改性豌豆蛋白 的起泡性能研究 11 1001502002503002% 4% 6% 8% 10%底物濃度起泡能力/mL01020304050607080泡沫穩(wěn)定性/minFAIFSI 圖二 底物濃度對(duì)起泡性與泡沫穩(wěn)定性的影響 酶解時(shí)間 分別采用 10 分鐘 ， 20 分鐘 ， 30 分鐘 ， 40 分鐘 ， 50 分鐘 ， 60 分鐘的酶解時(shí)間 試驗(yàn)，在酶濃度、底物濃度、酶解溫度、 pH 值不變的情況下，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，起泡能力隨之變大， 當(dāng)達(dá)到 30 分鐘時(shí)，起泡能力與泡沫穩(wěn)定性達(dá)到最大值， 而后起泡能力逐漸減小，達(dá)到最弱。在酶解初期，由于豌豆蛋白質(zhì)分子中的 — NH — COOH 之 間形成的氫鍵數(shù)目增多，形成的薄膜具有足夠的黏性和機(jī)械強(qiáng)度，使得豌豆蛋白的起泡性增加。隨著酶解過(guò)程的進(jìn)行， — NH — COOH 的數(shù)目不斷增加，電荷數(shù)目也隨之增加，當(dāng)增加到一定程度后，氣液薄膜強(qiáng)度降低，泡沫易破裂，起泡性也隨之降低 。 如圖 三 所示 ： 10015020025030010 20 30 40 50 60酶作用時(shí)間起泡性/mL0102030405060泡沫穩(wěn)定性/minFAIFSI 圖三 酶作用時(shí)間對(duì)起泡性與泡沫穩(wěn)定性的影響 溫度影響 分別采用 30℃ ， 40℃ ， 50℃ ， 60℃ ， 70℃的酶作用溫度 進(jìn)行試驗(yàn)， 隨著酶解溫 畢業(yè)論文 12 度的升高，起泡性和起泡穩(wěn)定性逐漸增大，當(dāng)溫度達(dá)到 50℃ 時(shí)，豌豆蛋白的起泡能力及起泡穩(wěn)定性最好，隨著溫度的繼續(xù)升高，起 泡性又逐漸減小，這可能是因?yàn)槊付加凶约旱淖钸m溫度，超過(guò)這一溫度，酶就會(huì)變性。 如圖所示 10015020025030035030 40 50 60 70酶作用溫度起泡能力/mL01020304050607080泡沫穩(wěn)定性/minFAIFSI 圖四 酶作用溫度對(duì)起泡性與泡沫穩(wěn)定性的影響 pH 影響 分別采用 pH5， pH6， pH7， pH8， pH9 作為酶作用 pH 值進(jìn)行 試驗(yàn)， 在 pH 逐步增加的時(shí)候，豌豆蛋白氣泡能力與泡沫穩(wěn)定性逐步增強(qiáng)，在 pH8 時(shí)，達(dá)到最大值，而后隨著 pH 值的進(jìn)一步增加 ，起泡能力與泡沫穩(wěn)定性慢慢減弱， pH 值主要是通過(guò)改變蛋白質(zhì)功能基團(tuán)的電離作用和雙電層厚度來(lái)影響蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用，最終來(lái)影響凝膠強(qiáng)度的變化。在近等電點(diǎn)處，蛋白質(zhì)通常 形成結(jié)塊狀凝膠；在極端 pH 值處，由于強(qiáng)烈的靜電排斥作用，蛋白質(zhì)則形成弱凝膠 。 如圖 五 所示 堿性蛋白酶改性豌豆蛋白 的起泡性能研究 13 1001502002503003505 6 7 8 9酶作用p H起泡能力/mL01020304050607080泡沫穩(wěn)定性/minFAIFSI 圖五 PH對(duì)起泡性與泡沫穩(wěn)定性的影響 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 根據(jù)單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，起泡性隨底物濃度的增加，變化趨勢(shì)較緩，所以我們固定底物濃度為 8%，考慮加酶量、時(shí)間、溫度、 pH 值四個(gè)因素之間的相互作用對(duì)酶解反應(yīng)的影響。本實(shí)驗(yàn)以起泡活性和起泡穩(wěn)定性為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)四因素三水平共 29 個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)分析實(shí)驗(yàn)，在此基礎(chǔ)上得出各因素之間的最佳組合。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)下 列表格： 表 6