【文章內(nèi)容簡介】 時左右進(jìn)入穩(wěn)定期。由于對數(shù)生長期的細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖極少，對細(xì)胞壁的酶解更易發(fā)生，因此我們進(jìn)行原生質(zhì)體的制備應(yīng)該選取處于對數(shù)生長期的菌體。由圖21可以確定B. licheniformis X47的最適菌齡為9小時。圖21 B. licheniformis X47生長曲線Fig. 21 The growth curves of B. licheniformis X47 酶解最佳條件的確定選擇地衣芽孢桿菌B. licheniformis X47為初始菌株，通過復(fù)壯培養(yǎng)，選擇達(dá)到最適菌齡的菌體，通過溶菌酶酶解制備原生質(zhì)體。通過溶菌酶酶解條件（本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化溶菌酶濃度、酶解時間和酶解溫度）對原生質(zhì)體形成率和再生率的影響，確定最佳的酶解條件。 mg/mL，酶解時間為30 min，酶解溫度為40 ℃。從圖22可以看出原生質(zhì)體的形成率隨著酶解濃度上升而不斷增加，形成率一直在增高， mg/mL以后，繼續(xù)增大酶液濃度，形成率反而有部分下降。 mg/ mg/mL的范圍內(nèi)，整體處于下降趨勢，隨著酶液濃度增高而下降，在2 mg/mL時，再生率下降明顯，之后幾乎處于0%。整體來說，原生質(zhì)體的形成率隨酶液濃度上升而增加，而再生率卻越來越低。在一定酶解時間和溫度下，濃度過高的酶液會損壞細(xì)胞壁，導(dǎo)致其無法再生[38]。而且有報道稱殘留的細(xì)胞壁有利于細(xì)胞壁的快速生成，有助于融合菌體細(xì)胞壁的生成[3940]。因此，過高的酶液濃度雖然有利于原生質(zhì)體的形成，卻會導(dǎo)致細(xì)胞壁的再生收到阻礙，影響融合菌體細(xì)胞壁的再生。終上所述，結(jié)合圖22不同酶濃度下原生質(zhì)體形成率和再生率，原生質(zhì)體形成率為96%，%，使得原生體形成率較高，同時具有一定的再生能力。圖22 酶解濃度對原生質(zhì)體形成率和再生率的影響Fig. 22 Effect of lysozyme concentration on formation rate and regeneration rate如圖23所示，在10到30分鐘，原生質(zhì)體的形成率上升明顯，過了30分鐘之后，形成率部分下降。而原生質(zhì)體再生率隨著時間的增加一直在下降，在30分鐘時，下降明顯。從圖中看來，原生質(zhì)體的形成并不是隨著時間增加不斷增加，在30分鐘時，形成率處于最高。根據(jù)譚蓓英等的研究，保持部分殘留細(xì)胞壁有利于細(xì)胞壁的快速生成。30分鐘酶解時間下，%，%。一定酶解時間內(nèi)，酶解的程度與酶解時間成正比，直到所有菌體被酶解為原生質(zhì)體為止。過長的酶解時間，會導(dǎo)致原生質(zhì)體融合后細(xì)胞壁難以生成，降低原生質(zhì)體的再生率，增強(qiáng)酶液中雜質(zhì)對菌體的作用；而過短的酶解時間，導(dǎo)致原生質(zhì)體形成率過低，原生質(zhì)體形成不完全。所以，確定最佳的酶解時間為30分鐘。圖23 酶解時間對原生質(zhì)體形成率和再生率的影響Fig. 23 Effect of lysozyme treated time on formation rate and regeneration rate從圖24可以明顯看出，酶解溫度越高，同時原生質(zhì)體形成率也越高，形成率和酶解溫度成正比。在25 ℃到35 ℃，原生質(zhì)體形成率上升明顯，35 ℃以后處于平緩，溫度到達(dá)50 ℃時有略微下降。原生質(zhì)體再生率隨著酶解溫度上升而下降，在35 ℃到50 ℃這段下降明顯。在一定的酶液濃度和酶解時間下，提高酶解溫度會使得酶作用更加活躍，提高酶促反應(yīng)速率，增加原生質(zhì)體的形成率，當(dāng)酶解溫度超過酶的最佳溫度以后，反而降低了酶活性，使酶解不充分，原生質(zhì)體形成率下降。因此，在保證一定再生率的情況下，選擇的最佳酶解溫度為40 ℃。圖24 酶解溫度對原生質(zhì)體形成率和再生率的影響Fig. 24 Effect of treated temperature on formation rate and regeneration rate 胡欣榮等[41]研究發(fā)現(xiàn)，酶解濃度對原生質(zhì)體形成率影響最大，其次是酶解溫度的影響，酶解時間影響最小。而對于再生率來說，酶解濃度影響最大，其次是酶解時間，酶解溫度影響最低。由于菌株的特異性，導(dǎo)致原生質(zhì)體的形成率和再生率影響因素不盡相同。有報道稱，由于外界條件的影響，即便是同一菌株原生質(zhì)體形成率和再生率也不是相同的[4244]。因此選擇對數(shù)生長期的菌體來制備原生質(zhì)體，并在酶解時保持一定的再生率，有助于原生質(zhì)體的制備。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)分析可知，B. licheniformis X47制備原生質(zhì)體選擇最佳菌齡為9 h， mg/mL，酶解時間為30 min，酶解溫度40 ℃。 酶解后原生質(zhì)體形成率、再生率和滅活率根據(jù)梁枝榮等[45]研究發(fā)現(xiàn)，以滅活原生質(zhì)體進(jìn)行融合，省去了復(fù)雜的遺傳標(biāo)記誘變篩選工作，避免了不良突變的發(fā)生，并在一定程度上提高了融合成功率；同時，還有能有效的區(qū)別融合子與親本，大大提高了后期篩選的效率。原生質(zhì)體滅活有紫外滅活和熱滅活兩種方式，熱滅活會對原生質(zhì)體細(xì)胞質(zhì)造成致死損傷，而紫外滅活則會對原生質(zhì)體的DNA造成致死損傷，并且不同的原生質(zhì)體在兩種滅活方式下會有較大的差別[46]。滅活條件過于溫和，滅活時間過短都會導(dǎo)致親本存活過多，影響子代融合的篩選。根據(jù)李祥楷等[47]研究發(fā)現(xiàn)，滅活不徹底的原生質(zhì)體，在進(jìn)行融合時，親本菌株可能會發(fā)生自融現(xiàn)象，對于子代融合子篩選造成不良影響?；谝陨峡紤]，對于B. licheniformis X47原生質(zhì)體的滅活選取紫外滅活20分鐘處理。表21原生質(zhì)體酶解后形成率、再生率和滅活率Table 21 Formation rate, regeneration rate and inactivation rate of protoplast after lysozyme treatmentStrainsFormation rate (%)Regeneration rate (%)Inactivationrate (%)Ultraviolet inactivated B. licheniformis X47100從表21看出，B. licheniformis X47經(jīng)過酶解后，%，%。原生質(zhì)體在20分鐘紫外滅活處理后，菌株的致死率為100%，將融合后親本菌株在再生培養(yǎng)基上生長可能性將至最低。 原生質(zhì)體融合條件的優(yōu)化原生質(zhì)體的融合是親本菌株在脫壁形成原生質(zhì)體后，在高滲環(huán)境下加入化學(xué)或物理助融因子，讓親本菌株原生質(zhì)體相互融合，重組，再而重新長出細(xì)胞壁，獲得融合子的過程[48]。本次實(shí)驗(yàn)選取的融合法是PEG融合法，通過PEG加入少量新生磷酸鈣誘導(dǎo)原生質(zhì)體的融合[49]。影響原生質(zhì)體的融合因數(shù)有很多，本次實(shí)驗(yàn)主要對B. licheniformis X47融合溫度、作用時間、pH和PEG濃度進(jìn)行研究確定。初始實(shí)驗(yàn)確定PEG6000濃度為400 g/L。如圖25所示，25℃到35℃，原生質(zhì)體的融合率顯著提高，超過35 ℃以后，融合率下降。適宜的溫度有助于增加細(xì)胞膜的流動，降低PEG粘度，提高原生質(zhì)體的融合，而溫度過高，影響到菌體本身而造成損失，降低融合率。因此，35℃時，原生質(zhì)體的融合率最高，選取3 5℃為最佳融合溫度。圖25溫度對原生質(zhì)體融合的影響Fig. 25 Effect of temperature on protoplast fusion圖26融合時間對原生質(zhì)體融合的影響Fig. 26 Effect of time on protoplast fusion如圖26所示，不同的融合時間對原生質(zhì)體的融合有著明顯的影響。本次實(shí)驗(yàn)選取的5 min、10 min、15 min、20 min和2 5min 共5個時間點(diǎn)，在515 min，融合率不斷升高，超過15 min后，融合率不斷下降，表明15 min后，PEG對細(xì)胞毒害作用顯現(xiàn)，導(dǎo)致融合率的下降。選擇15 min為最佳融合時間，原生質(zhì)體的融合率最高。因此在融合完畢以后，應(yīng)該迅速離心，之后以高滲溶液洗滌。從圖27可以明顯看出，400 g/L濃度的PEG6000融合率高于300 g/L和400 g/L的濃度。PEG是一種特殊脫水劑，能夠以分子橋形式存在于原生質(zhì)體膜之間，改變質(zhì)膜的流動性能，降低原生質(zhì)膜表面勢能，凝聚膜中的蛋白質(zhì)，從而形成一層易于融合的無蛋白磷脂雙分子層[48]。圖27 PEG濃度對原生質(zhì)體融合的影響Fig. 27 Effect of PEG concentration on protoplast fusion過高的PEG濃度會導(dǎo)致原生質(zhì)體中毒，過低會因?yàn)闈B透壓導(dǎo)致原生質(zhì)體破裂。通常，使用的PEG分子量為15006000，融合的PEG濃度在30%50%。在融合過程中，離子的影響也尤為明顯，在融合過程中，加入Ca2+和Mg2+能夠有效的誘導(dǎo)融合，特別是Ca2+被廣泛應(yīng)用于原生質(zhì)體的融合。Ca2+的存在，能夠改變原生質(zhì)體表面的電子分布，使兩個相互接觸的原生質(zhì)體局部融合，形成凹陷，構(gòu)成原生質(zhì)橋，大大促進(jìn)了原生質(zhì)融合的發(fā)生[50]。如圖28所示，不同的pH對原生質(zhì)體融合的影響很大，融合率最高，過高或過低的pH都會導(dǎo)致融合率的下降。由于本次實(shí)驗(yàn)選取了Ca2+作為融合劑，根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)得知，在Ca2+存在的情況下，堿性的融合環(huán)境能夠有效的促進(jìn)原生質(zhì)橋的發(fā)生，進(jìn)而增大融合幾率，這是因?yàn)槿诤蠒r不同的pH能夠原生質(zhì)體膜的電性狀態(tài)，從而影響原生質(zhì)體的融合。圖28 pH對原生質(zhì)體融合的影響Fig. 28 Effect of pH on protoplast fusion 通過上面一系列的單因素實(shí)驗(yàn)得出，融合最佳時間為15min，最佳溫度為35 ℃，最適PEG6000濃度為400 g/L。 B. licheniformis X47的基因組重排 第一輪基因組重排通過最適菌齡、最佳酶解條件和最佳融合條件的確定，親本菌株B. licheniformis X47以最適菌齡9小時，最佳酶解條件（酶解濃度1 mg/mL，酶解時間30 min，酶解溫度40 ℃），最佳融合條件（作用時間15 min，溫度35 ℃，PEG6000濃度400 g/L，融合pH ）進(jìn)行第一輪基因組重排。融合子進(jìn)行再生培養(yǎng)，再將所挑選菌株于發(fā)酵培養(yǎng)基中37 ℃，180 rpm，培養(yǎng)72 h，然后測定上清液酶活力。表21基因組重排第一輪篩選Table 21 Screening of first round of genome shufflingStrainsKeratinolytic activity（U/mL）StrainsKeratinolytic activity（U/mL）Y11177。Y121177。Y12177。Y122177。Y13177。Y123177。Y14177。Y124177。Y15177。Y125177。Y16177。Y126177。Y17177。Y12717