【文章內(nèi)容簡介】 %。在實(shí)驗(yàn)中，我們從不同的照射強(qiáng)度和不同的照射時間兩個方面進(jìn)行菌種的誘變。為了確定微波誘變最佳輸出功率，我們設(shè)定在照射時間為60 s時，取經(jīng)過稀釋的菌懸液5 mL于無菌培養(yǎng)皿中，開蓋放入微波爐，設(shè)定微波爐輸出頻率分別為20 %、40 %、60 %、80 %、100 %進(jìn)行照射處理，之后在4℃冰箱中放置2 h以減少回復(fù)突變，然后進(jìn)行平板培養(yǎng)，并進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)。對經(jīng)過培養(yǎng)的誘變菌株進(jìn)行存活率及正負(fù)突變率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，最終確定出最佳照射強(qiáng)度。通過上述實(shí)驗(yàn)，我們確定了最佳照射強(qiáng)度，在此基礎(chǔ)上，將裝有5mL稀釋菌液的培養(yǎng)皿開蓋置于微波爐中，設(shè)定照射時間分別為30 s、60 s、90 s、120 s、150 s、180 s，進(jìn)行誘變處理。將誘變后菌種在冰箱中冷藏2 h后進(jìn)行固體培養(yǎng)并進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)菌株存活率及正負(fù)突變率，最終確定最佳照射時間。(3)甲基磺酸乙酯誘變甲基磺酸乙酯是一種在微生物育種領(lǐng)域常用的化學(xué)誘變劑，簡稱EMS。EMS是一種重要的致癌物，在生物學(xué)上，EMS常用作突變體庫的建立、微生物育種等。EMS對微生物具有誘變效應(yīng)的機(jī)理主要是EMS能使基因中的鳥嘌呤烷基化，并使烷基化的鳥嘌呤與胸腺嘧啶配對，代替了胞嘧啶，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)換型突變效應(yīng)，另外，由于鳥嘌呤烷基活化導(dǎo)致糖苷鍵斷裂造成在DNA復(fù)制過程中堿基對發(fā)生替換。EMS誘發(fā)的這種染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)量方面的變化是其誘變效應(yīng)的主要表現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)選用EMS作為誘變因子，首先要確定EMS的濃度，由于EMS為液體物質(zhì)，我們需要從EMS母液出發(fā)進(jìn)行稀釋。 mL mL ，將其配置成體積分?jǐn)?shù)為5 %的EMS母液，震蕩搖勻后待用。分別取不同體積的菌液，將其與EMS母液進(jìn)行混合， %、 %、 %、 %、 %、 %，將混合液裝入無菌三角瓶中，在30 ℃下置于震蕩培養(yǎng)箱中震蕩培養(yǎng)30 h，最后加入一定量的2 %硫代硫酸鈉終止反應(yīng)。將誘變后菌種進(jìn)行固體培養(yǎng)并進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)誘變后菌種的存活率和正負(fù)突變率，確定最佳EMS濃度。（4）復(fù)合誘變在誘變育種過程中，如果對同一菌株進(jìn)行長期的單一因子誘變，會使該菌種對誘變劑產(chǎn)生“疲勞效應(yīng)”，從而會是誘變效果大大降低。單一誘變因子的長期使用會改變菌株的某些生理特性，比如可能會使菌株生長緩慢，代謝效率降低，對于真菌會導(dǎo)致孢子產(chǎn)生量減少，這些負(fù)面效應(yīng)不利于發(fā)酵工藝的控制。在實(shí)際生產(chǎn)中，復(fù)合誘變能有效的減少這些負(fù)面效應(yīng)。復(fù)合誘變包括多種誘變劑的先后使用，同一種誘變劑的重復(fù)使用和多種誘變劑的同時使用。人們普遍認(rèn)為，復(fù)合誘變具有明顯的協(xié)同效應(yīng)，多種誘變劑的合理搭配及使用效果要明顯優(yōu)于單一誘變劑的誘變效果。在本實(shí)驗(yàn)中，復(fù)合誘變實(shí)在單因子誘變基礎(chǔ)上進(jìn)行的，復(fù)合誘變所使用誘變劑分別為等離子體、微波和EMS三種因子。取5 mL稀釋過的菌懸液加入到無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，分別利用以上三種誘變因子在已確定的最佳條件下進(jìn)行第一次誘變處理。誘變后，將菌液混合均勻，并將其分成兩部分，一部分在30 ℃、200 r/min條件下震蕩培養(yǎng)8 h后，利用甘油保藏法進(jìn)行超低溫冷凍保藏，一部分作為出發(fā)菌株分別在三個誘變因子最佳誘變條件下進(jìn)行第二次誘變，如同第一次操作，第二次誘變所得菌液也分成兩部分，一部分保藏，另一部分作為出發(fā)菌株進(jìn)行第三次誘變處理，將所得菌液進(jìn)行超低溫冷凍保藏。誘變操作完成后，將第一次、第二次、第三次分別保藏的突變菌株進(jìn)行稀釋，涂布于含有80 g/L 3氰基吡啶的篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行菌種篩選，挑選生長狀況良好的菌株轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基在30 ℃、220 r/min條件下進(jìn)行震蕩培養(yǎng)，篩選出高酶活菌株，并進(jìn)行及時保藏。(5)遺傳穩(wěn)定性測定為保證誘變后菌株的遺傳穩(wěn)定性，減少回復(fù)突變對菌株酶活帶來的負(fù)面影響，我們需將挑選出來的酶活性最高的3株菌株進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)，每代菌株在30 ℃條件下培養(yǎng)48 h，連續(xù)傳代培養(yǎng)6 次，測定每次傳代菌株的酶活，并將遺傳穩(wěn)定性變化圖繪制成曲線圖。根據(jù)遺傳穩(wěn)定性曲線圖挑選出穩(wěn)定性良好的菌株進(jìn)行保藏，保藏于設(shè)定溫度為－70 ℃的超低溫冰箱中。(6)菌株酶活性測定方法在測定菌株酶活性高低時，我們需要嚴(yán)格控制酶反應(yīng)的時間和參與反應(yīng)酶的量。我們定義1 mL發(fā)酵液在1 min內(nèi)催化3氰基吡啶生成1 μmol煙酰胺所需的腈水合酶的數(shù)量定義為一個酶活力單位(U)。測定腈水合酶的酶活時，整個反應(yīng)過程是在磷酸緩沖液中進(jìn)行。將發(fā)酵液進(jìn)行離心，磷酸緩沖液洗滌兩次后，取1 mL菌懸液加入到9 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8 %的3氰基吡啶溶液，再向混合溶液中加入10 mL磷酸緩沖液，混勻后置于30 ℃條件下震蕩反應(yīng)5 min，反應(yīng)結(jié)束后用6 mol/L鹽酸溶液終止反應(yīng)。利用HPLC測定腈水合酶的沒活力。 目前在煙酰胺檢測方面最準(zhǔn)確的方法是高效液相色譜檢測法。高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）又稱“高速液相色譜”、“高分離度液相色譜”、“高壓液相色譜”。高效液相色譜技術(shù)使色譜技術(shù)的一個重要分支，其所用的流動相為液態(tài)，利用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相進(jìn)入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)完成分離各成分的分離，再經(jīng)檢測器檢測，從而實(shí)現(xiàn)對樣品的分析檢測[34]。和其他檢測技術(shù)相比，高效液相色譜有以下特點(diǎn)：（1）流動相為液體，在高壓作用下能使各成分快速完成分離。（2）分離效能高。（3）靈敏度高。檢測可達(dá)到納米級。（4）應(yīng)用范圍廣。在有機(jī)化合物中，70 %的物質(zhì)都能用高效液相色譜法進(jìn)行檢測分析，特別是高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性、熱穩(wěn)定性差的化合物。（5）分析速度快。一般檢測通常能夠在幾分鐘到幾十分鐘內(nèi)完成，一般不超過一個小時。但高效液相色譜也有其缺點(diǎn)，高效液相色譜具有“柱外效應(yīng)”。在從進(jìn)樣到檢測器之間，如果流動相的流型有變化，被分離物質(zhì)的任何擴(kuò)散和滯留都會顯著地導(dǎo)致色譜峰的加寬和柱效能的降低。目前高效液相色譜作為一種快速、準(zhǔn)確、直接的檢測技術(shù)已被廣泛應(yīng)用，尤其是在藥品檢測方面。一般藥品成分都比較復(fù)雜，尤其是中藥成分，檢測難度比較大。利用高效液相色譜技術(shù)能夠成功的對許多藥品的具體成分進(jìn)行分析測定，它也稱為目前藥品檢測采用的主流方法之一。在《中國藥典》中，使用高效液相色譜技術(shù)檢測的標(biāo)準(zhǔn)品已從80年代的7種增加到了2010年的2000余種。在生命科學(xué)領(lǐng)域，HPLC目前已成為生物化學(xué)家和醫(yī)學(xué)家在分子水平研究生命科學(xué)、臨床化學(xué)、遺傳工程、分子生物學(xué)等必不可少的工具，其在生化領(lǐng)域的應(yīng)用主要集中在兩個方面：（1）低分子量物質(zhì)，如氨基酸，有機(jī)酸，糖類，卟啉類，有機(jī)胺類、維生素類等的分離測定。（2）高分子物質(zhì)，如多肽，蛋白質(zhì)、酶、核糖核酸等的純化、分離和測定。關(guān)于高效液相色譜檢測，本實(shí)驗(yàn)室目前暫時使用的檢測條件為：檢測所使用的流動相為甲醇和水，其比例為：甲醇：水=1：4， mL/min，檢測樣品進(jìn)樣量為10 μL，色譜柱柱溫為30 ℃，紫外檢測波長為248 nm，色譜柱規(guī)格為C18柱。以上檢測條件均是經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行確定。在此條件下， min。如圖13所示：圖21 煙酰胺和3氰基吡啶出峰時間圖 The peak time of nicotinamide and 3cyanopyridin 在實(shí)驗(yàn)過程中，為了獲得更好的檢測結(jié)果，我們需要從各個檢測條件入手，對整個檢測過程進(jìn)行優(yōu)化處理，以期能在最短的時間內(nèi)檢測出煙酰胺的含量。(1) 繪制煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線 為了確定高效液相色譜檢測過程中檢出峰的峰面積與煙酰胺的含量是否具有良好的線性關(guān)系，我們需要繪制煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線： g/L煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液（ nm水系濾膜過濾），設(shè)定煙酰胺溶液進(jìn)樣量分別為5 μL 、10 μL，15 μL，20 μL，25 μL，以煙酰胺進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，檢出峰的峰面積為縱坐標(biāo)繪(2) HPLC紫外檢測波長的確定為了確定煙酰胺檢測波長，我們應(yīng)對煙酰胺及其生產(chǎn)所用底物3氰基吡啶進(jìn)行紫外吸收光譜掃描，確定兩者的紫外吸收峰后，為了得到最佳出峰效果，我們也要考慮在其他紫外波長下煙酰胺的處峰情況，在實(shí)驗(yàn)中，我們選取200 nm、220 nm、240 nm，260 nm五個紫外波長進(jìn)行測定，觀察在每個紫外吸收波長下煙酰胺的出峰情況，通過對比，選出最佳峰形所對應(yīng)的紫外吸收波長作為煙酰胺檢測波長。(3) HPLC流動相流量的確定高效液相色譜檢測所使用的流動相要是根據(jù)被檢測物質(zhì)的溶解性以及極性來確定的。被檢測物質(zhì)在流動相中應(yīng)該有很好的溶解性，并且要求流動相的洗脫能力要強(qiáng)，再者流動相與稀釋液不應(yīng)再樣品的紫外吸收波長處有吸收。HPLC檢測過程中，流動相流量的大小會直接影響到檢測保留時間的長短。選擇最佳的流動相流量，不僅能優(yōu)化流動相的使用量，更能使檢測時間縮短，檢測效果提高，這對檢測過程有著很重要的影響。在煙酰胺檢測過程中， mL/min、 mL/min、 mL/min、 mL/min、 mL/min、 mL/min六個不同的流量進(jìn)行試驗(yàn)，煙酰胺檢測出峰時間會有不同，我們將出峰時間短、檢測峰峰型最佳的流動相流量作為煙酰胺檢測最適宜流動相流量。(4) 高效液相色譜流動相比例的確定煙酰胺的高效液相色譜檢測所使用的流動相為甲醇和水的混合物。有機(jī)相的甲醇要求必須是色譜級檢測專用品。水相要求使用超純水，即蒸餾水除去幾乎所有離子雜質(zhì)。流動相中甲醇和水的比例決定了對煙酰胺的洗脫能力及檢測所用時間。因此，確定最佳的流動相比例對于煙酰胺的檢測具有非常重要的意義。在本實(shí)驗(yàn)中，我們設(shè)定了流動相的比例分別為甲醇：水=1：1：1：1：四個不同流動相比例進(jìn)行試驗(yàn)，通過出峰時間的不同來確定最佳的流動相比例。 煙酰胺在固體狀態(tài)下為白色結(jié)晶或者白色結(jié)晶粉末，在水中或者乙醇中有很高的溶解度。根據(jù)煙酰胺的物理性質(zhì)，我們設(shè)計(jì)了煙酰胺的提取過程并得到了煙酰胺的結(jié)晶。煙酰胺生產(chǎn)菌經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)48 h后，離心處理3次，每次離心條件為4000 r/min、15 min，每次離心后棄去上清液并加入蒸餾水與菌體震蕩混勻。離心是為了對菌體進(jìn)行清洗，充分洗去菌體中的發(fā)酵液成分。取出菌體加入蒸餾水制成菌懸液，取5 mL菌懸液加入15 mL含有8 %的3氰基吡啶溶液中，在30 ℃下進(jìn)行酶反應(yīng)，反應(yīng)過程中充分震蕩，并檢測3氰基吡啶反應(yīng)情況，當(dāng)確定3氰基吡啶已反應(yīng)完全后，將反應(yīng)液再次離心，棄去菌體沉淀。將所得上清液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥后，加入20 mL無水乙醇將所得固體溶解。將溶液放入45 ℃真空干燥箱中干燥后，對所得固體進(jìn)行檢測，并對煙酰胺的純度及收率進(jìn)行計(jì)算。在腈水合酶催化生產(chǎn)煙酰胺過程中，我們需要對轉(zhuǎn)化所需的各個條件加以控制，以實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定高效的生產(chǎn)。煙酰胺生產(chǎn)過程中的腈水合酶催化反應(yīng)所涉及的條件有：（1）微生物的菌齡。微生物法生產(chǎn)煙酰胺主要利用微生物體內(nèi)的腈水合酶，而微生物的菌齡影響著腈水合酶的活性，因此我們需要在腈水合酶活性最高的微生物生長時間內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)化生產(chǎn)。（2）菌體濃度。為了保證菌體充分與底物接觸，實(shí)現(xiàn)底物充分利用，我們需要控制微生物菌體的濃度。菌體濃度過大將會使菌體不能充分接觸底物，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率降低，菌體濃度過小將會使生產(chǎn)時間延長，降低生產(chǎn)效率。（3）溫度。溫度影響著腈水合酶的酶活性，為了保證菌體在高酶活情況下參加反應(yīng)，適宜的溫度是不可或缺的。（4）PH。微生物的生長需要適宜的PH，腈水合酶在合適的Ph條件下才能保證較高酶活性。（5）底物濃度。煙酰胺生產(chǎn)所使用的底物3氰基吡啶為一種劇毒性物質(zhì)，底物的毒性會降低微生物活性，從而降低腈水合酶的酶活性，選擇合適的底物濃度，不僅能降低底物對腈水合酶的影響，也能保證煙酰胺生產(chǎn)的高效進(jìn)行.(6)反應(yīng)時間。隨著酶反應(yīng)時間的延長，底物的持續(xù)消耗以及產(chǎn)物的不斷積累，腈水合酶的活性也會出現(xiàn)一定的變化。(7)產(chǎn)物濃度。在酶反應(yīng)過程中，產(chǎn)物的不斷積累會對腈水合酶活性造成抑制效應(yīng)，從而降低腈水合酶的活性。 為了獲得煙酰胺生產(chǎn)最適宜的條件，我們影響腈水合酶活性的因素分別進(jìn)行試驗(yàn)，以期確定最佳的生產(chǎn)條件組合。酶催化體系：配置PH %的3氰基吡啶溶液。取發(fā)酵液1 mL加入到10 mL 3氰基吡啶溶液和9 mL磷酸緩沖液混合溶液中，置于30 ℃下震蕩反應(yīng)10 min，用6 mol/L鹽酸溶液終止反應(yīng)（ mL），8000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行高效液相色譜分析，確定反應(yīng)體系中煙酰胺含量。(1) 最適菌體濃度的確定。將培養(yǎng)48 h的發(fā)酵液取20 mL在4000 r/min條件下離心15 min，放入60 ℃真空干燥箱內(nèi)烘干，測定菌體干重，計(jì)算出菌體在發(fā)酵液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。在保證其他條件不變情況下，我們先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，設(shè)定菌體濃度分別為1 %、 %、2 %、 %，確定大范圍內(nèi)的最佳菌體濃度，之后在小范圍內(nèi)進(jìn)行精細(xì)優(yōu)化， %、 %、 %、 %、 %、 %的菌液進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)完成后利用HPLC測定腈水合酶活性，以確定反應(yīng)所需最適菌種濃度。(2) 最佳菌齡的確定。 保證其他條件不變，根據(jù)煙酰胺生產(chǎn)菌種的生長曲線，選取菌齡（即發(fā)酵培養(yǎng)時間）分別為30 h、36 h、42 h、48 h、54 h、60 h的菌體進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)完成后測定腈水合酶活性，以確定反應(yīng)所需最佳菌齡。(2) 最適底物濃度的確定。保證其他條件不變，我們進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，設(shè)定底物濃度分別為1 %、5 %、10 %、15 %，之后根據(jù)較高腈水合酶活性所對應(yīng)的底物濃度，我們進(jìn)行精細(xì)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，設(shè)定底物3氰基吡啶分別為7 %、8 %、9 %、10 %、11 %、12 %五個不同的濃度進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)完成后測定腈水合酶活性，以確定反應(yīng)所需最適底物濃度。(4) 最適溫度的確定。 保證其他條件不變，在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，我們將濃度范圍設(shè)置為26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃，在此范圍內(nèi)確定高酶活菌株所對應(yīng)的溫度，之后進(jìn)行精細(xì)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)， ℃、29 ℃、 ℃、30 ℃、 ℃、31 ℃五個不同溫度進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)完成后測定腈水合酶活性，以確定反應(yīng)所需最適溫度。(5) 最適PH保證其他條件不變，在預(yù)實(shí)驗(yàn)中我們將PH變化范圍設(shè)置為8，在此范圍內(nèi)確定較高酶活菌株所對應(yīng)的溫度，之后進(jìn)行精細(xì)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，、、反應(yīng)完成后測定腈水合酶活性，以確定反應(yīng)所需最適PH。(6)最佳反應(yīng)時