【正文】 的影響，進(jìn)而探索各因素之間的交互作用等，最終求的最佳實(shí)驗(yàn)條件。具體來(lái)講，響應(yīng)面法是利用合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)并通過(guò)實(shí)驗(yàn)得到一些數(shù)據(jù)，通過(guò)對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸方程分析來(lái)得到擬合因素和響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，并尋求出最優(yōu)的工藝參數(shù)。(7)產(chǎn)物濃度對(duì)腈水合酶活性的影響為了確定煙酰胺生產(chǎn)過(guò)程中煙酰胺的積累對(duì)腈水合酶活性的影響，我們?cè)诒ＷC其他反應(yīng)條件不變情況下，在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)定反應(yīng)體系內(nèi)的煙酰胺濃度分別為40 g/L、50 g/L、60 g/L、70 g/L、80 g/L，測(cè)定不同濃度煙酰胺存在時(shí)對(duì)腈水合酶活性的影響并繪制曲線。(5) 最適PH保證其他條件不變，在預(yù)實(shí)驗(yàn)中我們將PH變化范圍設(shè)置為8，在此范圍內(nèi)確定較高酶活菌株所對(duì)應(yīng)的溫度，之后進(jìn)行精細(xì)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，、反應(yīng)完成后測(cè)定腈水合酶活性，以確定反應(yīng)所需最適PH。(4) 最適溫度的確定。(2) 最適底物濃度的確定。(2) 最佳菌齡的確定。將培養(yǎng)48 h的發(fā)酵液取20 mL在4000 r/min條件下離心15 min，放入60 ℃真空干燥箱內(nèi)烘干，測(cè)定菌體干重，計(jì)算出菌體在發(fā)酵液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。取發(fā)酵液1 mL加入到10 mL 3氰基吡啶溶液和9 mL磷酸緩沖液混合溶液中，置于30 ℃下震蕩反應(yīng)10 min，用6 mol/L鹽酸溶液終止反應(yīng)（ mL），8000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行高效液相色譜分析，確定反應(yīng)體系中煙酰胺含量。 為了獲得煙酰胺生產(chǎn)最適宜的條件，我們影響腈水合酶活性的因素分別進(jìn)行試驗(yàn)，以期確定最佳的生產(chǎn)條件組合。(7)產(chǎn)物濃度。煙酰胺生產(chǎn)所使用的底物3氰基吡啶為一種劇毒性物質(zhì)，底物的毒性會(huì)降低微生物活性，從而降低腈水合酶的酶活性，選擇合適的底物濃度，不僅能降低底物對(duì)腈水合酶的影響，也能保證煙酰胺生產(chǎn)的高效進(jìn)行.(6)反應(yīng)時(shí)間。微生物的生長(zhǎng)需要適宜的PH，腈水合酶在合適的Ph條件下才能保證較高酶活性。溫度影響著腈水合酶的酶活性，為了保證菌體在高酶活情況下參加反應(yīng)，適宜的溫度是不可或缺的。菌體濃度過(guò)大將會(huì)使菌體不能充分接觸底物，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率降低，菌體濃度過(guò)小將會(huì)使生產(chǎn)時(shí)間延長(zhǎng)，降低生產(chǎn)效率。（2）菌體濃度。煙酰胺生產(chǎn)過(guò)程中的腈水合酶催化反應(yīng)所涉及的條件有：（1）微生物的菌齡。將溶液放入45 ℃真空干燥箱中干燥后，對(duì)所得固體進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)煙酰胺的純度及收率進(jìn)行計(jì)算。取出菌體加入蒸餾水制成菌懸液，取5 mL菌懸液加入15 mL含有8 %的3氰基吡啶溶液中，在30 ℃下進(jìn)行酶反應(yīng)，反應(yīng)過(guò)程中充分震蕩，并檢測(cè)3氰基吡啶反應(yīng)情況，當(dāng)確定3氰基吡啶已反應(yīng)完全后，將反應(yīng)液再次離心，棄去菌體沉淀。煙酰胺生產(chǎn)菌經(jīng)過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)48 h后，離心處理3次，每次離心條件為4000 r/min、15 min，每次離心后棄去上清液并加入蒸餾水與菌體震蕩混勻。 煙酰胺在固體狀態(tài)下為白色結(jié)晶或者白色結(jié)晶粉末，在水中或者乙醇中有很高的溶解度。因此，確定最佳的流動(dòng)相比例對(duì)于煙酰胺的檢測(cè)具有非常重要的意義。水相要求使用超純水，即蒸餾水除去幾乎所有離子雜質(zhì)。(4) 高效液相色譜流動(dòng)相比例的確定煙酰胺的高效液相色譜檢測(cè)所使用的流動(dòng)相為甲醇和水的混合物。選擇最佳的流動(dòng)相流量，不僅能優(yōu)化流動(dòng)相的使用量，更能使檢測(cè)時(shí)間縮短，檢測(cè)效果提高，這對(duì)檢測(cè)過(guò)程有著很重要的影響。被檢測(cè)物質(zhì)在流動(dòng)相中應(yīng)該有很好的溶解性，并且要求流動(dòng)相的洗脫能力要強(qiáng)，再者流動(dòng)相與稀釋液不應(yīng)再樣品的紫外吸收波長(zhǎng)處有吸收。(1) 繪制煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線 為了確定高效液相色譜檢測(cè)過(guò)程中檢出峰的峰面積與煙酰胺的含量是否具有良好的線性關(guān)系，我們需要繪制煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線： g/L煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液（ nm水系濾膜過(guò)濾），設(shè)定煙酰胺溶液進(jìn)樣量分別為5 μL 、10 μL，15 μL，20 μL，25 μL，以煙酰胺進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，檢出峰的峰面積為縱坐標(biāo)繪(2) HPLC紫外檢測(cè)波長(zhǎng)的確定為了確定煙酰胺檢測(cè)波長(zhǎng)，我們應(yīng)對(duì)煙酰胺及其生產(chǎn)所用底物3氰基吡啶進(jìn)行紫外吸收光譜掃描，確定兩者的紫外吸收峰后，為了得到最佳出峰效果，我們也要考慮在其他紫外波長(zhǎng)下煙酰胺的處峰情況，在實(shí)驗(yàn)中，我們選取200 nm、220 nm、240 nm，260 nm五個(gè)紫外波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定，觀察在每個(gè)紫外吸收波長(zhǎng)下煙酰胺的出峰情況，通過(guò)對(duì)比，選出最佳峰形所對(duì)應(yīng)的紫外吸收波長(zhǎng)作為煙酰胺檢測(cè)波長(zhǎng)。在此條件下， min。關(guān)于高效液相色譜檢測(cè)，本實(shí)驗(yàn)室目前暫時(shí)使用的檢測(cè)條件為：檢測(cè)所使用的流動(dòng)相為甲醇和水，其比例為：甲醇：水=1：4， mL/min，檢測(cè)樣品進(jìn)樣量為10 μL，色譜柱柱溫為30 ℃，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為248 nm，色譜柱規(guī)格為C18柱。在生命科學(xué)領(lǐng)域，HPLC目前已成為生物化學(xué)家和醫(yī)學(xué)家在分子水平研究生命科學(xué)、臨床化學(xué)、遺傳工程、分子生物學(xué)等必不可少的工具，其在生化領(lǐng)域的應(yīng)用主要集中在兩個(gè)方面：（1）低分子量物質(zhì)，如氨基酸，有機(jī)酸，糖類，卟啉類，有機(jī)胺類、維生素類等的分離測(cè)定。利用高效液相色譜技術(shù)能夠成功的對(duì)許多藥品的具體成分進(jìn)行分析測(cè)定，它也稱為目前藥品檢測(cè)采用的主流方法之一。目前高效液相色譜作為一種快速、準(zhǔn)確、直接的檢測(cè)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用，尤其是在藥品檢測(cè)方面。但高效液相色譜也有其缺點(diǎn)，高效液相色譜具有“柱外效應(yīng)”。（5）分析速度快。（4）應(yīng)用范圍廣。（3）靈敏度高。和其他檢測(cè)技術(shù)相比，高效液相色譜有以下特點(diǎn)：（1）流動(dòng)相為液體，在高壓作用下能使各成分快速完成分離。高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）又稱“高速液相色譜”、“高分離度液相色譜”、“高壓液相色譜”。利用HPLC測(cè)定腈水合酶的沒(méi)活力。測(cè)定腈水合酶的酶活時(shí)，整個(gè)反應(yīng)過(guò)程是在磷酸緩沖液中進(jìn)行。(6)菌株酶活性測(cè)定方法在測(cè)定菌株酶活性高低時(shí)，我們需要嚴(yán)格控制酶反應(yīng)的時(shí)間和參與反應(yīng)酶的量。(5)遺傳穩(wěn)定性測(cè)定為保證誘變后菌株的遺傳穩(wěn)定性，減少回復(fù)突變對(duì)菌株酶活帶來(lái)的負(fù)面影響，我們需將挑選出來(lái)的酶活性最高的3株菌株進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)，每代菌株在30 ℃條件下培養(yǎng)48 h，連續(xù)傳代培養(yǎng)6 次，測(cè)定每次傳代菌株的酶活，并將遺傳穩(wěn)定性變化圖繪制成曲線圖。誘變后，將菌液混合均勻，并將其分成兩部分，一部分在30 ℃、200 r/min條件下震蕩培養(yǎng)8 h后，利用甘油保藏法進(jìn)行超低溫冷凍保藏，一部分作為出發(fā)菌株分別在三個(gè)誘變因子最佳誘變條件下進(jìn)行第二次誘變，如同第一次操作，第二次誘變所得菌液也分成兩部分，一部分保藏，另一部分作為出發(fā)菌株進(jìn)行第三次誘變處理，將所得菌液進(jìn)行超低溫冷凍保藏。在本實(shí)驗(yàn)中，復(fù)合誘變實(shí)在單因子誘變基礎(chǔ)上進(jìn)行的，復(fù)合誘變所使用誘變劑分別為等離子體、微波和EMS三種因子。復(fù)合誘變包括多種誘變劑的先后使用，同一種誘變劑的重復(fù)使用和多種誘變劑的同時(shí)使用。單一誘變因子的長(zhǎng)期使用會(huì)改變菌株的某些生理特性，比如可能會(huì)使菌株生長(zhǎng)緩慢，代謝效率降低，對(duì)于真菌會(huì)導(dǎo)致孢子產(chǎn)生量減少，這些負(fù)面效應(yīng)不利于發(fā)酵工藝的控制。將誘變后菌種進(jìn)行固體培養(yǎng)并進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)誘變后菌種的存活率和正負(fù)突變率，確定最佳EMS濃度。 mL mL ，將其配置成體積分?jǐn)?shù)為5 %的EMS母液，震蕩搖勻后待用。EMS誘發(fā)的這種染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)量方面的變化是其誘變效應(yīng)的主要表現(xiàn)。EMS是一種重要的致癌物，在生物學(xué)上，EMS常用作突變體庫(kù)的建立、微生物育種等。將誘變后菌種在冰箱中冷藏2 h后進(jìn)行固體培養(yǎng)并進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)菌株存活率及正負(fù)突變率，最終確定最佳照射時(shí)間。對(duì)經(jīng)過(guò)培養(yǎng)的誘變菌株進(jìn)行存活率及正負(fù)突變率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，最終確定出最佳照射強(qiáng)度。在實(shí)驗(yàn)中，我們從不同的照射強(qiáng)度和不同的照射時(shí)間兩個(gè)方面進(jìn)行菌種的誘變。在本實(shí)驗(yàn)中，菌種誘變所使用的微波爐為廣東美的公司制造的型號(hào)為KJ23BDE型微波爐，微波輸出功率800 W，頻率為2450 MHz。熱效應(yīng)主要是指在一定功率和一定頻率下，通過(guò)電磁輻射對(duì)微生物進(jìn)行照射，引起局部溫度上升，從而引起微生物體內(nèi)一些生理生化反應(yīng)的變化，甚至死亡；非熱效應(yīng)是指在電磁波作用下，特別是在長(zhǎng)時(shí)間及低溫的電磁場(chǎng)作用下，生物體并沒(méi)有明顯的溫度變化，或者生物體自身溫度變化在自然范圍內(nèi)，但卻可以產(chǎn)生強(qiáng)烈的生物效應(yīng)，并在生物體內(nèi)產(chǎn)生各種生理，生化功能的變化，表現(xiàn)為頻率和功率的選擇性上。然后對(duì)突變株的突變率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，選擇最高正突變率所對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)作為誘變處理時(shí)間。致死率計(jì)算公式為： 致死率=100%﹣存活率 存活率=(誘變后存活菌落數(shù)相應(yīng)稀釋倍數(shù)) ／(對(duì)照平板菌落數(shù)相應(yīng)稀釋倍數(shù))根據(jù)致死率與誘變時(shí)間對(duì)應(yīng)關(guān)系，我們可以制作出致死率曲線。本裝置采用紫外滅菌，以空氣為傳導(dǎo)介質(zhì)，在常壓下，滅菌室內(nèi)電極經(jīng)過(guò)特定條件激發(fā)產(chǎn)生輝光放電形成等離子體。該儀器所使用的氣體為氦氣，在使用前需先設(shè)定氣體流量為10 mL/min，打開(kāi)紫外燈殺菌處理20 min。將出發(fā)菌株從超低溫冰箱中取出在平板上活化，在30 ℃培養(yǎng)48 h，之后轉(zhuǎn)接兩代，從第三代生長(zhǎng)良好的平板中挑出菌落最大、長(zhǎng)勢(shì)最好的菌落作為出發(fā)菌株，轉(zhuǎn)接斜面培養(yǎng)48 h之后，在200 r/min旋轉(zhuǎn)式搖床上震蕩培養(yǎng)36 h，%生理鹽水進(jìn)行稀釋，通過(guò)血球計(jì)數(shù)板鏡檢實(shí)驗(yàn)使菌液濃度控制在108 個(gè)/mL。比較普遍采用的等離子體消毒裝置有高頻電磁場(chǎng)、激光和微波等離子體，等離子云有空氣、氦氣、氮?dú)?、氧氣、鹵素氣體等，所研究的微生物有大腸桿菌、釀酒酵母、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草桿菌等[31~33]。其中的活性自由基及射線，如紫外線、γ射線等對(duì)微生物具有很強(qiáng)的滅殺作用。在此過(guò)程中，電子、光子、正負(fù)離子得以形成。(1)等離子體誘變等離子體主要指電離氣體，只有當(dāng)帶電粒子密度達(dá)到其建立的空間電荷足以限制其自身運(yùn)動(dòng)時(shí)，帶電粒子才會(huì)影響整個(gè)體系的性質(zhì)，此時(shí)才會(huì)形成等離子體[29]。液體種子培養(yǎng)基：斜面培養(yǎng)菌種取一環(huán)接入液體種子培養(yǎng)基，之后放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30 ℃，搖瓶裝液量為30 mL，轉(zhuǎn)速為200 r/min，培養(yǎng)時(shí)間為36 h。7H2O ，谷氨酸鈉 1，脲 7，鈷離子 12 mg，pH ，115 ℃滅菌15 min。7H2O ，谷氨酸鈉 1，pH ，115 ℃滅菌15 min。 篩選培養(yǎng)基（g/L）：3氰基吡啶 8，葡萄糖 15，酵母膏 3，NaCl 1，MgSO4 ，K2HPO4 ，瓊脂 15，pH ，115 ℃滅菌15 min。2 材料與方法 材料 諾卡氏菌HD1220，河南大學(xué)生命科學(xué)院生物工程實(shí)驗(yàn)室保藏。 利用高效液相色譜進(jìn)行煙酰胺檢測(cè)，在現(xiàn)有檢測(cè)條件的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)高效液相色譜檢測(cè)中流動(dòng)相比例、紫外檢測(cè)波長(zhǎng)、流動(dòng)相流量、進(jìn)樣量等條件進(jìn)行優(yōu)化，確定出煙酰胺檢測(cè)最佳的檢測(cè)條件。在單因素誘變的基礎(chǔ)上進(jìn)行三種影響因素的復(fù)合誘變實(shí)驗(yàn)，通過(guò)不斷的嘗試與篩選，最終選育出具有高酶活性的煙酰胺產(chǎn)生菌株。在生產(chǎn)過(guò)程中，人們應(yīng)該適時(shí)的對(duì)煙酰胺產(chǎn)量及品質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，因此確立一種快速有效的檢測(cè)手段對(duì)煙酰胺生產(chǎn)也具有重要意義。在此工藝中，微生物菌種的活性決定了煙酰胺的產(chǎn)量。因此，在工業(yè)中如何有效提高煙酰胺的產(chǎn)量成為人們重視的一個(gè)問(wèn)題。醫(yī)藥、食品、化妝品以及飼料等等領(lǐng)域都有非常廣泛的應(yīng)用。 ，水分子、原料中的腈分子和鈷離子三者相互結(jié)合，氰基中的CN三鍵在此基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)激活并發(fā)生水合反應(yīng)，使得OH基攻擊氰基并與其中C離子形成一個(gè)亞酰胺RC(OH)=NH，異構(gòu)化后的亞酰胺即為酰胺類物質(zhì) [28]。在透析實(shí)驗(yàn)中游離鈷離子全部消失，說(shuō)明酶活性部位已將它們?nèi)拷Y(jié)合并在螯合作用下轉(zhuǎn)化為自身重要的一環(huán)，由此可見(jiàn)鈷離子對(duì)腈水合酶的重要性。 腈水合酶為誘導(dǎo)酶，在特定誘導(dǎo)劑存在下才能產(chǎn)生腈水合酶，以鈷型腈水合酶為例，菌體培養(yǎng)期間腈水合酶的酶活性和其含量只有在有鈷離子存在情況下才會(huì)有提高。能與鈷離子螯合的腈水合酶是由α和β兩個(gè)亞基組成的組成的一種水溶性蛋白物質(zhì)，由于酶蛋白產(chǎn)生過(guò)程中誘導(dǎo)因子的不同，兩個(gè)亞基具有了不同的結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致了不同種類微生物內(nèi)腈水合酶分子量的差異，例如菌株Rhodococcus KDa，而菌株Rhodococcus rhodochrous JI 體內(nèi)的腈水合酶則有520 KDa和130 KDa兩種大小[27]。目前已發(fā)現(xiàn)的能與腈水合酶發(fā)生螯合作用的螯合因子主要有鐵離子和鈷離子。這些菌屬中常用的微生物菌株有：Nocardia ，Brevibacterium imperialis CBS48974，Rhodocaccus rhodochrous JI， Corynebacterium pseudodiphterium ZBB41，Breviterium R312，Rhodocaccus ，Rhodocaccus sp. YH33，Alcaligenes faecalis ARCC8750，Alcaligenes faecalis JM，Pseudonocarda thermophila JCM3095，Becillus ，Brecterium 等[21~25]。自然界中存在的能夠利用腈類物質(zhì)的微生物種類很多，但一般利用率非常低，后來(lái)科學(xué)家們將這些微生物進(jìn)行人工馴化培養(yǎng)，通過(guò)改變微生物生長(zhǎng)條件及代謝機(jī)制，實(shí)現(xiàn)了微生物腈水合酶活性的提高。腈類化合物一般是由與工業(yè)生產(chǎn)中某些物質(zhì)間的反應(yīng)所產(chǎn)生的副產(chǎn)物，這些物質(zhì)一般具有很高的毒性，存在于工業(yè)廢水，腈類物質(zhì)很難被分解掉，而微生物體內(nèi)腈水合酶是腈類物質(zhì)最好的催化劑。此后通過(guò)對(duì)微生物轉(zhuǎn)化腈類物質(zhì)必須的腈水合酶進(jìn)行進(jìn)一步研究，通過(guò)研究得出腈水合酶參與反應(yīng)所需最佳條件，該公司實(shí)現(xiàn)了腈水合酶活力的不斷提高，并讓丙烯酰胺產(chǎn)量實(shí)現(xiàn)三次大幅度提高，到21世紀(jì)初期，丙烯酰胺產(chǎn)量已經(jīng)提高到20000 t/a。因此，針對(duì)煙酰胺生產(chǎn)來(lái)說(shuō)，實(shí)現(xiàn)微生物發(fā)酵生產(chǎn)煙酰胺具有非常重大的意義，這也將改變煙酰胺生產(chǎn)工業(yè)長(zhǎng)久以來(lái)的一些難以改變的不利因素[18]。這是微生物發(fā)酵相比于一般發(fā)酵最為顯著地優(yōu)越性。（5）環(huán)境污染小。（4）高度的專一性和選擇性。（3）微生物的自主調(diào)控。（2）原材料物質(zhì)易得且廉價(jià)。在氧化生產(chǎn)過(guò)程中，:1，因此工業(yè)上煙酰胺產(chǎn)量的決定性因素依舊是原材料物質(zhì)的產(chǎn)量?；瘜W(xué)合成工藝的原材料主要是吡啶類物