【正文】 A蛋白 ATP 一些酶的轉(zhuǎn)換數(shù) 目 錄 6．在低底物濃度時(shí)， kcat/Km代表酶的催化效率 [ E t ] [ S ] K m V = k c a t 當(dāng) [S] Km時(shí) kcat/Km是此二級(jí)反應(yīng)的速率常數(shù) ， 也稱特異性常數(shù) ， 其單位是 L/(mol 目 錄 5． kcat代表酶的轉(zhuǎn)換數(shù) kcat = Vmax /[Et] kcat表示酶被底物完全飽和時(shí) ， 單位時(shí)間內(nèi)每個(gè)酶分子 （ 或活性中心 ） 催化底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物的分子數(shù) 。 目 錄 4． Vmax是酶被底物完全飽和時(shí)的反應(yīng)速率 當(dāng)所有的酶均與底物形成 ES時(shí)（即 [ES] = [Et]），反應(yīng)速率達(dá)到最大。此時(shí)， Km代表酶對(duì)底物的親和力。 目 錄 ? 10?3 己 N乙酰氨基葡萄糖 溶菌酶 ? 10?2 H2O2 過(guò)氧化氫酶 ? 10?3 D乳糖 ?半乳糖苷酶 ? 10?3 N苯甲酰酪氨酰胺 ? 10?1 甘氨酰酪氨酰甘氨酸 胰凝乳蛋白酶 ? 10?2 HCO3? 碳酸酐酶 ? 10?3 D果糖 5 ? 10?5 D葡萄糖 4 ? 10?4 ATP 己糖激酶（腦） Km（ mol/L） 底物 酶 一些酶的底物的 Km 目 錄 3． Km在一定條件下可表示酶對(duì)底物的親和力 k 1 K m = k 2 + k 3 當(dāng) k3 k2時(shí)， Km ? k2/k1。 同一酶對(duì)其所催化的不同底物有不同的 Km； 不同酶對(duì)同一底物也有其各自的 Km 。 k1 ([Et]－ [ES]) [S]＝ k2 [ES] + k3 [ES] k2+k3 ＝ Km （米氏常數(shù)） k1 令： 則 (2)變?yōu)?: ([Et]－ [ES]) [S] ＝ Km [ES] (2) ＝ ([Et]－ [ES])[S] k2+k3 [ES] k1 整理得： 目 錄 將 (3)代入 (1) 得 k3[Et][S] Km + [S] (4) V＝ ──── 當(dāng)?shù)孜餄舛群芨撸瑢⒚傅幕钚灾行娜匡柡蜁r(shí)，即 [Et]＝ [ES]， 反應(yīng)達(dá)最大速率 Vmax＝ k3[ES]＝ k3[Et] (5) [ES]＝ ─── [Et][S] Km + [S] (3) 整理得 : 將 (5)代入 (4)得米氏方程式： Vmax[S] Km + [S] V＝ ──── 目 錄 Km＝ [S] ∴ Km值等于酶促反應(yīng)速率為最大反應(yīng)速率一半時(shí)的底物濃度，單位是 mol/L。 即 V＝ k3[ES] (1) S的總濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于 E的總濃度，因此在反應(yīng)的初始階段， S的濃度可認(rèn)為不變即 [S]＝ [St]。 [S] V Vmax 目 錄 目 錄 （二）反應(yīng)速率與底物濃度的關(guān)系可用米 曼氏方程式表示 1．米 曼氏方程定量地描述底物濃度與反應(yīng)速率的關(guān)系 中間產(chǎn)物 酶促反應(yīng)模式 —— 中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō) E + S k1 k2 k3 ES E + P 目 錄 ※ 1913年 Michaelis和 Menten提出反應(yīng)速率與底物濃度關(guān)系的數(shù)學(xué)方程式 ， 即米 曼氏方程式 ，簡(jiǎn)稱米氏方程式 (Michaelis equation)。 [S] V Vmax 目 錄 隨著底物濃度的增高 反應(yīng)速率不再成正比例加速；反應(yīng)為混合級(jí)反應(yīng)。這種通過(guò)偶聯(lián)其他酶并對(duì)此酶促產(chǎn)物進(jìn)行直接檢測(cè) ， 間接地反映待測(cè)酶反應(yīng)的底物或產(chǎn)物變化量的方法稱為 酶偶聯(lián)測(cè)定法 （ enzyme coupled assay） 外加的酶稱為 工具酶或輔助酶 （ auxiliary enzyme） 產(chǎn)物可直接檢測(cè)的酶稱為 指示酶 （ indicator enzyme） 丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶 丙氨酸 + ?酮戊二酸 ????? 丙酮酸 + 谷氨酸 乳酸脫氫酶 丙酮酸 + NADH + H+ ????? 乳酸 + NAD+ （在 340nm處有吸收峰） （在 340nm處無(wú)吸收峰） 目 錄 二、酶促反應(yīng)速率受底物濃度的影響 （一）酶促反應(yīng)速率對(duì)底物濃度作圖呈矩形雙曲線 在酶濃度和其他反應(yīng)條件不變的情況下 ， 反應(yīng)速率 V對(duì)底物濃度 [S]作圖 呈矩形雙曲線 。 還原型 （ Fe2+） 細(xì)胞色素 c在波長(zhǎng) 550nm處有明顯的吸收峰 ， 而氧化型 （ Fe3+） 則無(wú)；細(xì)胞色素 C氧化酶對(duì)細(xì)胞色素 C的氧化反應(yīng) ， 可以直接在波長(zhǎng) 550nm處檢測(cè)一定時(shí)間內(nèi)還原型細(xì)胞色素 C的減少過(guò)程 。 目 錄 （三）有三類方法可用來(lái)測(cè)定底物或產(chǎn)物的變化量 1．直接測(cè)定法是對(duì)底物或產(chǎn)物量的變化進(jìn)行直接檢測(cè) 有些酶促反應(yīng)可在反應(yīng)進(jìn)行一定時(shí)間后 ， 不用任何輔助反應(yīng)便可直接測(cè)定反應(yīng)液中底物或產(chǎn)物的濃度 。 在規(guī)定的實(shí)驗(yàn)條件下 （ 如溫度 、 pH的限定和足夠的底物濃度等 ） ， 每分鐘催化 1?mol底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物所需要的酶量為 1個(gè)國(guó)際單位 （ IU） 。 由于底物的消耗量不易測(cè)定，所以實(shí)際工作中經(jīng)常是測(cè)定單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物的生成量。 研究前提 目 錄 一、采用酶促反應(yīng)初速率來(lái)研究酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué) （一）酶活性是指酶催化化學(xué)反應(yīng)的能力 衡量酶活性的尺度是酶促反應(yīng)速率的大小。 ※ 研究一種因素的影響時(shí)，其余各因素均恒定。 目 錄 胰凝乳蛋白酶的親核催化、共價(jià)催化和酸 堿催化機(jī)制 目 錄 第三節(jié) 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué) The Kiics of Enzymatic Reactions 目 錄 ? 概念 研究各種因素對(duì) 酶促反應(yīng)速率 的影響，并加以定量的闡述。 這種催化作用稱為 親核催化（ nucleophilic catalysis） 。這種催化機(jī)制稱為 共價(jià)催化 （ covalent catalysis）。 這些基團(tuán)在酶活性中心的準(zhǔn)確定位有利于質(zhì)子的轉(zhuǎn)移 ， 這種 一般酸 堿催化 （ general acidbase catalysis） 可以使反應(yīng)速率提高 102?105倍 。 疏水環(huán)境可使底物分子脫溶劑化 （ desolvation） ， 排除周圍大量水分子對(duì)酶和底物分子中功能基團(tuán)的干擾性吸引或排斥 ， 防止二者之間形成水化膜 ， 利于底物和酶分子之間的直接密切接觸和相互結(jié)合 。 底物 B 底物 A 酶 酶 底物復(fù)合物 目 錄 在疏水環(huán)境中進(jìn)行酶反應(yīng)有很大的優(yōu)越性 ， 此現(xiàn)象稱為 表面效應(yīng) （ surface effect） 。 酶不能使底物形成過(guò)渡態(tài) ， 則沒(méi)有結(jié)合能的釋放 ， 也就不能催化反應(yīng)的進(jìn)行 。 四、酶對(duì)底物具有多種催化機(jī)制 目 錄 目 錄 羧肽酶的誘導(dǎo)契合模式 底物 目 錄 2．形成酶 底物過(guò)渡態(tài)復(fù)合物過(guò)程中釋放結(jié)合能 底物與酶的活性中心相互誘導(dǎo)契合形成過(guò)渡態(tài)化合物 ， 過(guò)渡態(tài)與酶的活性中心以次級(jí)鍵 (氫鍵 、 離子鍵 、 疏水鍵 )相結(jié)合 ， 這一過(guò)程是釋能反應(yīng) ， 所釋放的能量稱為 結(jié)合能 (binding energy)。 （二）酶的活性中心的構(gòu)象有利于酶與底物結(jié)合及催化反應(yīng) 胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和彈性蛋白酶活性中心“口袋” 目 錄 酶的活性中心對(duì)底物具有高度的特異性 酶活性中心與底物結(jié)合時(shí)，發(fā)生構(gòu)象改變，相互誘導(dǎo)契合，增加與底物的互補(bǔ)性 大多數(shù)情況下底物與酶活性中心最初的結(jié)合是非共價(jià)性的 氫鍵 離子鍵 疏水鍵 van der Waals力 酶與底物結(jié)合的力 目 錄 （一）酶與底物之間的相互作用表現(xiàn)有多種效應(yīng) 1．酶與底物結(jié)合時(shí)相互誘導(dǎo)發(fā)生構(gòu)象改變 誘導(dǎo)契合假說(shuō)（ inducedfit hypothesis） 酶 底物復(fù)合物 E + S E + P ES 酶與底物相互接近時(shí) ， 其結(jié)構(gòu)相互誘導(dǎo) 、相互變形和相互適應(yīng) ， 進(jìn)而相互結(jié)合 。 常見(jiàn)的必需基團(tuán) 絲氨酸殘基的 羥基 組氨酸殘基的 咪唑基 半胱氨酸殘基的 巰基 酸性氨基酸殘基的 羧基 目 錄 ? 活性中心內(nèi)的必需基團(tuán) 結(jié)合基團(tuán) (binding group) 與底物相結(jié)合 催化基團(tuán) (catalytic group) 催化底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物 位于活性中心以外，維持酶活性中心應(yīng)有的空間構(gòu)象所必需。 目 錄 三、酶活性中心是酶與底物結(jié)合并將底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的特定部位 或稱活性部位 (active site)， 指 必需基團(tuán)在空間結(jié)構(gòu)上彼此靠近 ， 組成具有特定空間結(jié)構(gòu) 、 能與底物特異結(jié)合并將底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的區(qū)域 。 胰蛋白酶水解由堿性氨基酸（精氨酸和賴氨酸）的羧基所形成的肽鍵。 目 錄 多數(shù)酶可對(duì)一類化合物或一種化學(xué)鍵起催化作用，這種對(duì)底物分子不太嚴(yán)格的選擇性稱為 相對(duì)特異性（ relative specificity）。 酶對(duì)底物的這種極其嚴(yán)格的選擇性稱為 絕對(duì)特異性 （ absolute specificity） 。 （一）酶對(duì)底物具有極高的催化效率 目 錄 酶與一般催化劑催化效率的比較 底物 催化劑 反應(yīng)溫度（ ℃ ） 速度常數(shù) 苯酰胺 H+ 52 106 OH 53 106 α胰凝乳蛋白酶 25 尿素 H+ 62 107 脲酶 21 106 H2O2 Fe2+ 56 22 過(guò)氧化氫酶 22 107 目 錄 酶的 特異性或?qū)Ｒ恍?（ specificity） 酶對(duì)其所催化的底物和反應(yīng)類型具有嚴(yán)格的選擇性，一種酶只作用于一種化合物，或一類化學(xué)鍵，催化一定的化學(xué)反應(yīng)并產(chǎn)生一定結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物的現(xiàn)象。 任何催化劑都不能改變底物和產(chǎn)物自身的自由能 。 目 錄 反應(yīng)總能量改變 非催化反應(yīng)活化能 酶促反應(yīng) 活化能 一般催化劑催 化反應(yīng)的活化能 能 量 反 應(yīng) 過(guò) 程 底物 產(chǎn)物 酶促反應(yīng)活化能的改變 結(jié)合能 目 錄 2．活化能的降低可使反應(yīng)速率呈指數(shù)上升 化學(xué)反應(yīng)速率與自由能變化的關(guān)系 d[S] kBT V = ? ?? = ?? [S] e ??G*/RT dt h [S]代表底物（ substrate）濃度 kB是玻爾茨曼常數(shù)（ Boltzmann constant）（ ?10?23JK1） h是普朗克常數(shù)（ Planck constant）（ ?10?） ?G*代表反應(yīng)的活化能 在標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下反應(yīng)活化能降低 1倍，反應(yīng)速率可提高約 5000倍，呈現(xiàn)指數(shù)上升 一般講，酶的催化效率比非催化反應(yīng)高 105?1017倍 目 錄 （二）酶與一般催化劑一樣能加速化學(xué)反應(yīng)而不改變反應(yīng)的平衡點(diǎn) 酶與一般催化劑一樣 ， 只能加快反應(yīng)速率 ，使其縮短到達(dá)反應(yīng)平衡的時(shí)間 ， 而不能改變反應(yīng)的平衡點(diǎn) 。 酶和一般催化劑加速反應(yīng)的機(jī)制都是降低反應(yīng)的活化能 (activation energy)。 LDH同工酶 紅細(xì)胞 白細(xì)胞 血清 骨骼肌 心肌 肺 腎 肝 脾 LDH1 （ H4） 43 12 0 73 14 43 2 10 LDH2 （ H3M） 44 49 0 24 34 44 4 25 LDH3（ H2M2） 12 33 5 3 35 12 11 10 LDH4 （ HM3） 1 6 16 0 5 1 27 20 LDH5 （ M4） 0 0 79 0 12 0 56 5 人體各組織器官 LDH同工酶譜（活性 %） 目 錄 （三）檢測(cè)組織器官同工酶譜的變化有重要的臨床意義 在代謝調(diào)節(jié)上起著重要的作用； 用于解釋發(fā)育過(guò)程中階段特有的代謝特征； 同工酶譜的改變有助于對(duì)疾病的診斷； 同工酶可以作為遺傳標(biāo)志，用于遺傳分析研究。 同工酶主要由于 基因倍增 （ duplication）和 趨異 （ divergence） 所致 。 編號(hào)中 4個(gè)數(shù)字中第 1個(gè)數(shù)字是酶的分類號(hào) ， 第 2個(gè)數(shù)字代表在此類中