【文章內(nèi)容簡介】 H N： HN C CH R OH R O R 酶分子中具有酸 堿催化作用的基團(tuán) 目 錄 酶可與底物形成瞬時共價鍵 很多酶在催化過程中，與底物形成瞬時共價鍵，底物與酶形成共價鍵后被激活，并很容易進(jìn)一步水解形成產(chǎn)物和游離的酶。這種催化機(jī)制稱為 共價催化 （ covalent catalysis）。 A?B + E： ??? A?E + B H2O A?E ??? A + E： + B 目 錄 酶舉例 親核基團(tuán) 共價結(jié)合中間產(chǎn)物 絲氨酸蛋白酶 絲氨酸 ?OH ?；? 巰基酶 半胱氨酸 ?SH 酰基酶 ATP酶 天冬氨酸 ?COO? 磷?；? 含吡哆醛的酶 賴氨酸 ?NH2 Schiff堿 磷酸甘油酸變位酶 組氨酸 磷?；? 谷氨酰胺合成酶 酪氨酸 ?OH 腺嘌呤酶 酶的親核基團(tuán)與底物共價結(jié)合 目 錄 酶可通過親核催化或親電子催化加速反應(yīng) 酶活性中心有的催化基團(tuán)屬于親核基團(tuán) ， 可以提供電子給帶有部分正電荷的過渡態(tài)底物 ， 形成瞬間共價鍵 。 這種催化作用稱為 親核催化（ nucleophilic catalysis） 。 親電子催化 （ electrophilic catalysis） 可使酶活性中心的陽離子親電子基團(tuán)與富含電子的底物形成共價鍵 。 目 錄 胰凝乳蛋白酶的親核催化、共價催化和酸 堿催化機(jī)制 目 錄 第三節(jié) 酶促反應(yīng)動力學(xué) The Kiics of Enzymatic Reactions 目 錄 ? 概念 研究各種因素對 酶促反應(yīng)速率 的影響，并加以定量的闡述。 ? 影響因素包括有 酶濃度、底物濃度、 pH、溫度、抑制劑、激活劑等。 ※ 研究一種因素的影響時，其余各因素均恒定。 目 錄 I. 單底物 、 單產(chǎn)物反應(yīng)； II. 酶促 反應(yīng)速率 （ velocity， V） 一般在規(guī)定的反應(yīng)條件下 ， 用單位時間內(nèi)底物的消耗量和產(chǎn)物的生成量來表示 ； III. 反應(yīng)速率取其初速率 ， 即底物的消耗量很?。?一般在 5﹪ 以內(nèi) ） 時的反應(yīng)速率； IV. 底物濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于酶濃度 。 研究前提 目 錄 一、采用酶促反應(yīng)初速率來研究酶促反應(yīng)動力學(xué) （一）酶活性是指酶催化化學(xué)反應(yīng)的能力 衡量酶活性的尺度是酶促反應(yīng)速率的大小。 酶促反應(yīng)速率可用單位時間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的生成量來表示。 由于底物的消耗量不易測定，所以實際工作中經(jīng)常是測定單位時間內(nèi)產(chǎn)物的生成量。 目 錄 酶的活性 : 以 國際單位 （ international unit, IU） 表示 。 在規(guī)定的實驗條件下 （ 如溫度 、 pH的限定和足夠的底物濃度等 ） ， 每分鐘催化 1?mol底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物所需要的酶量為 1個國際單位 （ IU） 。 目 錄 催量 （ Katal） 1IU＝ 10－ 9 Kat 1催量是指在特定條件下，每秒鐘將 1mol底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物所需的酶量 比活性 （ specific activity）：比較酶的純度 比活性單位是每 mg蛋白質(zhì)所含酶的國際單位數(shù)， 其單位是 IU mg 蛋白 ?1 目 錄 （二）酶促反應(yīng)初速率是反應(yīng)剛剛開始時測得的反應(yīng)速率 酶促反應(yīng)初速率是指反應(yīng)剛剛開始，各種影響因素尚未發(fā)揮作用時的酶促反應(yīng)速率，即反應(yīng)時間進(jìn)程曲線為直線部分時的反應(yīng)速率。 目 錄 （三）有三類方法可用來測定底物或產(chǎn)物的變化量 1．直接測定法是對底物或產(chǎn)物量的變化進(jìn)行直接檢測 有些酶促反應(yīng)可在反應(yīng)進(jìn)行一定時間后 ， 不用任何輔助反應(yīng)便可直接測定反應(yīng)液中底物或產(chǎn)物的濃度 。這類測定方法稱為 直接測定法 （ direct assay） 。 還原型 （ Fe2+） 細(xì)胞色素 c在波長 550nm處有明顯的吸收峰 ， 而氧化型 （ Fe3+） 則無；細(xì)胞色素 C氧化酶對細(xì)胞色素 C的氧化反應(yīng) ， 可以直接在波長 550nm處檢測一定時間內(nèi)還原型細(xì)胞色素 C的減少過程 。 目 錄 有些酶促反應(yīng)的底物和產(chǎn)物不能直接進(jìn)行檢測 ，必須增加一些輔助試劑來達(dá)到檢測的目的 ， 這種方法稱為 間接測定法 （ indirect assay） 2．間接測定法利用非酶輔助反應(yīng)對底物或產(chǎn)物量的變化進(jìn)行間接檢測 目 錄 3．酶偶聯(lián)測定法是間接反映初始反應(yīng)的底物或產(chǎn)物量的變化量 許多酶促反應(yīng)的底物和產(chǎn)物雖然不能直接檢測 ， 但可以與另外的酶反應(yīng)相偶聯(lián) ， 偶聯(lián)的酶以第一個酶的產(chǎn)物為底物 ， 或以此類推 ， 以最后的酶反應(yīng)產(chǎn)物可以直接檢測為目的 。這種通過偶聯(lián)其他酶并對此酶促產(chǎn)物進(jìn)行直接檢測 ， 間接地反映待測酶反應(yīng)的底物或產(chǎn)物變化量的方法稱為 酶偶聯(lián)測定法 （ enzyme coupled assay） 外加的酶稱為 工具酶或輔助酶 （ auxiliary enzyme） 產(chǎn)物可直接檢測的酶稱為 指示酶 （ indicator enzyme） 丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶 丙氨酸 + ?酮戊二酸 ????? 丙酮酸 + 谷氨酸 乳酸脫氫酶 丙酮酸 + NADH + H+ ????? 乳酸 + NAD+ （在 340nm處有吸收峰） （在 340nm處無吸收峰） 目 錄 二、酶促反應(yīng)速率受底物濃度的影響 （一）酶促反應(yīng)速率對底物濃度作圖呈矩形雙曲線 在酶濃度和其他反應(yīng)條件不變的情況下 ， 反應(yīng)速率 V對底物濃度 [S]作圖 呈矩形雙曲線 。 當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時 反應(yīng)速率與底物濃度成正比；反應(yīng)為一級反應(yīng)。 [S] V Vmax 目 錄 隨著底物濃度的增高 反應(yīng)速率不再成正比例加速；反應(yīng)為混合級反應(yīng)。 [S] V Vmax 目 錄 當(dāng)?shù)孜餄舛雀哌_(dá)一定程度 酶被底物所飽和，反應(yīng)速率不再增加，達(dá)最大速率；反應(yīng)為零級反應(yīng)。 [S] V Vmax 目 錄 目 錄 （二）反應(yīng)速率與底物濃度的關(guān)系可用米 曼氏方程式表示 1．米 曼氏方程定量地描述底物濃度與反應(yīng)速率的關(guān)系 中間產(chǎn)物 酶促反應(yīng)模式 —— 中間產(chǎn)物學(xué)說 E + S k1 k2 k3 ES E + P 目 錄 ※ 1913年 Michaelis和 Menten提出反應(yīng)速率與底物濃度關(guān)系的數(shù)學(xué)方程式 ， 即米 曼氏方程式 ，簡稱米氏方程式 (Michaelis equation)。 [S]： 底物濃度 V： 不同 [S]時的反應(yīng)速率 Vmax： 最大反應(yīng)速率 (maximum velocity) Ｋ m： 米氏常數(shù) (Michaelis constant) Ｖ Vmax[S] Km + [S] ＝ ── 目 錄 米 曼氏方程式推導(dǎo)基于兩個假設(shè)： E與 S形成 ES復(fù)合物的反應(yīng)是快速平衡反應(yīng)，而 ES分解為 E及 P的反應(yīng)為慢反應(yīng)，反應(yīng)速率取決于慢反應(yīng) 。 即 V＝ k3[ES] (1) S的總濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于 E的總濃度，因此在反應(yīng)的初始階段， S的濃度可認(rèn)為不變即 [S]＝ [St]。 目 錄 2．米 曼氏方程的推導(dǎo)過程引入了穩(wěn)態(tài)概念 穩(wěn)態(tài)： 是指 ES的生成速率與分解速率相等，即 [ES]恒定。 k1 ([Et]－ [ES]) [S]＝ k2 [ES] + k3 [ES] k2+k3 ＝ Km （米氏常數(shù)） k1 令： 則 (2)變?yōu)?: ([Et]－ [ES]) [S] ＝ Km [ES] (2) ＝ ([Et]－ [ES])[S] k2+k3 [ES] k1 整理得： 目 錄 將 (3)代入 (1) 得 k3[Et][S] Km + [S] (4) V＝ ──── 當(dāng)?shù)孜餄舛群芨?，將酶的活性中心全部飽和時，即 [Et]＝ [ES]， 反應(yīng)達(dá)最大速率 Vmax＝ k3[ES]＝ k3[Et] (5) [ES]＝ ─── [Et][S] Km + [S] (3) 整理得 : 將 (5)代入 (4)得米氏方程式： Vmax[S] Km + [S] V＝ ──── 目 錄 Km＝ [S] ∴ Km值等于酶促反應(yīng)速率為最大反應(yīng)速率一半時的底物濃度，單位是 mol/L。 2 ＝ Km + [S] Vmax Vmax[S] Vmax V [S] Km Vmax/2 （三）動力學(xué)參數(shù)可用來比較酶促反應(yīng)的動力學(xué)性質(zhì) 1． Km值等于即刻反應(yīng)速率達(dá)到 Vmax一半時的底物濃度 目 錄 2． Km是酶的特征性常數(shù) 在酶的結(jié)構(gòu) 、 溶液 pH、 溫度等條件不變的情 況下 ， 酶促反應(yīng)底物的 Km不因反應(yīng)中酶濃度的改 變而不同。 同一酶對其所催化的不同底物有不同的 Km； 不同酶對同一底物也有其各自的 Km 。 Km的范圍多在 106～ 102mol/L之間。 目 錄 ? 10?3 己 N乙酰氨基葡萄糖 溶菌酶 ? 10?2 H2O2 過氧化氫酶 ? 10?3 D乳糖 ?半乳糖苷酶 ? 10?3 N苯甲酰酪氨酰胺 ? 10?1 甘氨酰酪氨酰甘氨酸 胰凝乳蛋白酶 ? 10?2 HCO3? 碳酸酐酶 ? 10?3 D果糖 5 ? 10?5 D葡萄糖 4 ? 10?4 ATP 己糖激酶（腦） Km（ mol/L） 底物 酶 一些酶的底物的 Km 目 錄 3． Km在一定條件下可表示酶對底物的親和力 k 1 K m = k 2 + k 3 當(dāng) k3 k2時， Km ? k2/k1。即相當(dāng)于 ES分解為E + S 的解離常數(shù)（ dissociation constant, Ks）。此時， Km代表酶對底物的親和力。 Km越大，表示酶對底物的親和力越??； Km越小，表示酶對底物的親和力越大。 目 錄 4． Vmax是酶被底物完全飽和時的反應(yīng)速率 當(dāng)所有的酶均與底物形成 ES時（即 [ES] = [Et]），反應(yīng)速率達(dá)到最大。 即 Vmax = k3 [Et]。 目 錄 5． kcat代表酶的轉(zhuǎn)換數(shù) kcat = Vmax /[Et] kcat表示酶被底物完全飽和時 ， 單位時間內(nèi)每個酶分子 （ 或活性中心 ） 催化底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物的分子數(shù) 。 kcat也稱為酶的轉(zhuǎn)換數(shù) (turnover number)，單位是 s?1 。 多數(shù)酶的轉(zhuǎn)換數(shù)在 1?104 s?1之間 目 錄 酶 底 物 轉(zhuǎn)換數(shù) （ s?1） 過氧化氫酶 H2O2 40 000 000 碳酸酐酶 HCO3? 400 000 乙酰膽堿酯酶 乙酰膽堿 14 000 ?內(nèi)酰胺酶 芐青霉素 2 000 延胡索酸酶 延胡索酸 800 Rec A蛋白 ATP 一些酶的轉(zhuǎn)換數(shù) 目 錄 6．在低底物濃度時， kcat/Km代表酶的催化效率 [ E t ] [ S ] K m V = k c a t 當(dāng) [S] Km時 kcat/Km是此二級反應(yīng)的速率常數(shù) ， 也稱特異性常數(shù) ， 其單位是 L/(mol S) 。 反應(yīng)速率的大小取決于 E和 S由于相互滲透而相互碰撞的速率 。 .這種被滲透控制的碰撞速率(diffusioncontrolled rate of encounter， DCRE)的上限是 108? L/(mol S) 。 kcat/Km越接近此數(shù)據(jù) ， 酶的催化效率越高 。 目 錄 酶 kcat/Km [L/(mol S) ] 乙酰膽堿酯酶 ? 108 碳酸酐酶 ? 107 過氧化氫酶 4 ? 107 巴豆酸酶 ? 108 延胡索酸酶 ? 108 磷酸丙糖異構(gòu)酶 ? 108 ?內(nèi)酰胺酶 1 ? 108 超氧化物歧化酶 7 ? 109 一些 kcat/Km值接近 DCRE的酶 目 錄 （四）采用作圖法可求得酶促反應(yīng)的動力學(xué)參數(shù) 1．林 貝氏作圖法是求得 Vmax和 Km的最常用方法 林 貝氏方程式（ LineweaverBurk equation） 將米氏方程式兩邊取倒數(shù)，并加以整理，則得出米氏方程式的雙倒數(shù)形式 ： V 1 = K m