超高壓對(duì)胃蛋白酶酶解特性的影響畢業(yè)論文(編輯修改稿)
2024-07-22 18:27 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 研究發(fā)現(xiàn)：酶活性中心的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)，較低壓力可使常壓下完整組織中經(jīng)常被隔離的酶和基質(zhì)相接觸，加速酶解反應(yīng)的進(jìn)行，從而暴露出更多結(jié)合位點(diǎn)，易于酶解反應(yīng)的進(jìn)行 [9]。低的壓力也可以通過解離蛋白，松散其蛋白結(jié)構(gòu)，從而暴露出更多結(jié)合位點(diǎn)，使一些在常壓下受抑制的酶激活。Cheftel [10]在研究高壓對(duì)蛋白質(zhì)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)：壓力不僅可通過解鏈、離解或蛋白質(zhì)水解提高肉的嫩度，且可通過解鏈增加蛋白質(zhì)食品對(duì)蛋白酶的敏感度，提高可消化性和降低過敏性。本課題組前期的研究也發(fā)現(xiàn)：高壓處理不僅可使肉類嫩化效果得到較大的改善 [1115]，還可顯著提高胰蛋白酶對(duì)肉類蛋白質(zhì)的消化能力 [16]，表明該處理手段不僅可用于肉類蛋白的結(jié)構(gòu)與功能特性改善，還可用于提高肉類蛋白的酶解敏感性。本實(shí)驗(yàn)的目的是通過單因素法確定不同的壓力、保壓時(shí)間作用，酪蛋白變性特性，以水解度為特征性指標(biāo)，研究該蛋白在胃蛋白酶作用下，以高壓處理的胃蛋白酶水解酪蛋白，測(cè)定其酶解產(chǎn)物的水解度、不同氮形式（可溶性氮、氨基氮、肽基氮）及含量，并通過對(duì)酶解產(chǎn)物中巰基含量、疏水性的分析，研究了高壓處理對(duì)胃蛋白酶酶解特性的影響，以期為進(jìn)一步探索超高壓促進(jìn)胃蛋白酶酶解的機(jī)理打下基礎(chǔ)。1 試驗(yàn)材料與方法 試驗(yàn)材料 胃蛋白酶：上海晶純生化科技股份有限公司，酶活力 1:15000；酪蛋白：北1京索萊寶科技有限公司。主要試劑：甲醛，鹽酸，三（羥甲基）氨基甲烷（Tris） ，乙二胺四乙酸（EDTA）二鈉，甘氨酸，尿素， 5,5’二硫雙2硝基苯甲酸，三氯乙酸，磷酸鹽，1苯胺基8萘磺酸等。實(shí)驗(yàn)中所用其他化學(xué)試劑均為分析純。 儀器設(shè)備 超高壓處理裝置（包頭科發(fā)公司） ；多功能真空包裝機(jī)：山東省諸城市中鼎機(jī)械；SHAC 數(shù)顯水浴恒溫振蕩器：江蘇省金壇市華峰儀器有限公司； PHS3C型精密 pH 計(jì)：上海雷磁儀器廠；KjeltecTM8400 全自動(dòng)凱氏定氮儀，F(xiàn)OSS Denmark；TU1810 型紫外分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；MULTIFUGE XIR 型冷凍離心機(jī) Thermo German；ALPHA12LD 型冷凍干燥機(jī)，Christ German；凝膠色譜儀。 實(shí)驗(yàn)方法 胃蛋白酶解液： 在測(cè)定前，胃蛋白酶溶于 的鹽酸溶液，使?jié)舛冗_(dá)到 2mg/ml，4℃冷藏，等待高壓處理或作為對(duì)照樣。 超高壓處理 酶溶液用聚乙烯塑料袋真空密封包裝(50mL/袋 )，置于4℃的冰箱中保存(待用)。用不同壓力(50 、100、150、200MPa)及不同保壓時(shí)間 (120min)處理酶溶液，對(duì)照樣：未經(jīng)高壓處理的酶液。 酶解反應(yīng) 將一定量的酪蛋白在磁力攪拌器上邊攪拌邊加入到處理過的酶溶液及對(duì)照液中，制成底物濃度為10mg/ml的懸浮液，置于水浴恒溫振蕩器中55℃酶解6h(反應(yīng)體系的pH、酶濃度、底物濃度、酶解溫度和酶解時(shí)間已經(jīng)過優(yōu)化)。酶解結(jié)束后沸水浴滅酶10 min使酶失活，冷卻至室溫后，4℃冷藏，測(cè)定其不同指標(biāo)。 指標(biāo)的測(cè)定 酶解液水解度的測(cè)定 甲醛滴定法測(cè)酶解液水解度的測(cè)定 [17,18]，取蛋白酶解液5mL置于100mL容量瓶中，定容、混勻后取20mL置于200mL燒杯中，加入60mL去CO 2水， mol/。加入10mL 甲醛溶液， mol/L標(biāo)準(zhǔn)NaOH ，同時(shí)用蒸餾水代替酶解液做空白對(duì)照。記錄所消耗的標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液的體積，計(jì)算水解度（DH） 。2 (1) 試樣中氨基酸態(tài) 氮含量（X）按下式進(jìn)行計(jì)算： 式中：X—試樣中氨基酸態(tài)氮含量，單位為克每百毫升（ g /100mL） ；V1—測(cè)定用試樣稀釋液加入甲醛后消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，單 位為毫升（mL） ；V2—試劑空白試驗(yàn)加入甲醛后消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，單位為毫升（mL） ； V3—試劑稀釋液取用量，單位為毫升（mL） ； c—?dú)溲趸c標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度，單位為摩爾每升（mol/L） ； — mL氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量，單位為克（g） 。 氨基氮、可溶性氮和肽基氮含量分析 氨基氮含量測(cè)定：采用甲醛滴定法 [19]。 可溶性氮含量測(cè)定：凱氏定氮法。 肽基氮含量測(cè)定：水解物上清液中肽基氮含量占原料總氮量百分比，即水解產(chǎn)物中可溶性氮含量與氨基氮含量之差。 巰基(SH)含量分析 參照Beveridge等SH 分析方法 [20]。 巰基含量分析：， Tris—Gly—8MUrea溶液， DTNB溶液(4mg/mL用Tris—Gly緩沖液配制)，迅速混合后在25℃下保溫反應(yīng)30min，用分光光度計(jì)測(cè)定它在λ=412nm下吸光度值(A 412)，同時(shí)測(cè)定空白值(以蒸餾水代替樣品測(cè)定)。每組樣測(cè)定3組，取平均值為最終結(jié)果。計(jì)算公式如下： μmol SH/g= D/C =106/(104)，104是Ellman試劑的摩爾消光系數(shù)；A 412為λ=412nm下吸光度值； D為稀釋系數(shù)，這里D=；C為樣品的蛋白質(zhì)最終濃度，單位為mg/mL。 疏水性測(cè)定%10%DH??總 氮 含 量氨 基 酸 態(tài) 氮 含 量）（ 10/)321???（X3 采用ANS(1苯胺基8萘磺酸)熒光探針法 [21]，取酪蛋白的不
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