【文章內(nèi)容簡介】 稱取一定量的玉米醇溶蛋白，并分別溶于 乙醇濃度 70%、 75%、 80%、 85%、 90%五個(gè)濃度梯度 的乙醇溶液，將反應(yīng)體系的鹽酸濃度調(diào)制 pH為 9，反應(yīng)溫度固定為 45℃，反應(yīng)時(shí)間為 1h，底物濃度 5%,酶濃度 5u/ml。反應(yīng)過程中，用水浴搖床進(jìn)行震蕩，使玉米醇溶蛋白與氫氧化鈉充分反應(yīng)。按照 。 按照 測 定溶解度 . 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)本科畢業(yè)論文 5 酶添加量對胰蛋白酶水解玉米醇溶蛋白的影響 將酶濃度分別配成為 1u/ml， 3u/ml， 5u/ml， 7u/ml， 5u/ml， 9u/ml 五 個(gè)梯度的懸浮液。用移液管稱取一定量的鹽酸。將反應(yīng)體系的鹽酸濃度調(diào)制 pH 為 9，反應(yīng)溫度固定為 45℃，反應(yīng)時(shí)間為 1h，乙醇濃度為 80%。反應(yīng)過程中，用水浴搖床震蕩，使玉米醇溶蛋白與氫氧化鈉充分反應(yīng)。按照 測定水解程度。按照 測定溶解度 . 反應(yīng)溫度對胰蛋白酶水解玉米醇溶蛋白的影響 將反應(yīng)體系的鹽酸濃度調(diào)制 pH 為 9，反 應(yīng)時(shí)間為 1h，乙醇濃度為 80%，底物濃度5%,酶濃度 5u/ml并分別在 35℃、 40℃、 45℃、 50℃ 、 55℃五個(gè)溫度梯度下反應(yīng)中，用水浴搖床震蕩，使玉米醇溶蛋白與氫氧化鈉充分反應(yīng)。按照 測定水解程度。按照 測定溶解度 . 對胰蛋白酶水解玉米醇溶蛋白的影響 將反應(yīng)體系的濃度分別調(diào)為 pH8， ， 9， ， 10 五 個(gè)濃度梯度進(jìn)行反應(yīng)1h，而乙醇濃度為 80%，溫度為 45℃，底物濃度 5%,酶濃度 5u/ml。反應(yīng)過程中，用水浴搖床震蕩，使玉米醇溶蛋白與氫氧化鈉充分反應(yīng)按 照 測定水解程度。按照 測定溶解度 .。 玉米醇溶蛋白水解物與金屬離子螯合能力的研究 對二價(jià)鐵離子螯合能力的研究 [12] 采用 Ferrozine 顯色法測定二價(jià)鐵螯合能力。準(zhǔn)確吸取 250 μ L 1mg mL1 的樣品溶液（樣品最終濃度為 100 μ g mL1）直接與 X μ L 1 mmol L1 的 FeCl2溶液混合（最終濃度為 10~60 μ mol L1，此溶液現(xiàn)用現(xiàn)配 FeCl2），加入一定量的超純水，使反應(yīng)體系終體積為 mL。混勻后，放置 2 min，再加入 1mL 500 μmol L1 的 Ferrozine 顯色劑水溶液（ Ferrozine 終濃度為 200 μ mol L1），充分振蕩、混勻?；旌象w系在室溫下靜置 10 min，使 Fe2+與 Ferrozine 充分結(jié)合，形成 Fe2+Ferrozine 復(fù)合物，然后用紫外分光光度法在 562 nm 條件下測吸光值。對照樣中加入一定量的 EDTA 鈉鹽溶液（終濃度為 10 μ mol L1） 對二價(jià)鋅離子螯合能力的研究 [13] 取 5 mL 反應(yīng)液于燒杯中濃縮至近干，加入 15 mL 無水乙醇，混勻 后 5 000 r/min離心 20 min，取沉淀并用蒸餾水定容至 50 mL。用 EDTA 絡(luò)合滴定法測定螯合態(tài)鋅的含量。移取容量瓶中溶液 20 mL 至錐形瓶中，加兩滴二甲酚橙指示劑（ %水溶液），滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 20%的六亞甲基四胺 鹽酸緩沖液（ pH ）至溶液呈穩(wěn)定的紫紅色后再加入 4 mL 緩沖液，用已標(biāo)定的 mol/L EDTA 溶液滴定至溶液由 紫紅色變成黃色，記錄 EDTA 的消耗量 一些重要的理化分析方法 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)本科畢業(yè)論文 蛋白質(zhì)含量 — 凱氏定氮法 [8,11] 鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液配制方法 — GB/T ； 甲基紅 溴甲酚綠混合指示劑配制方法 — GB/T 。 稱取 g 或 5mL 待測樣品加入到消化管中，分別稱取 g 硫酸鉀、 g 硫酸銅加入消化管，加入 10mL 濃硫酸，將消化管置入消化爐中消化，用小火緩慢加熱，使溶液保持在沸點(diǎn)以下，待泡沫消失后，加強(qiáng)火力并保持管內(nèi)液體沸騰，逐漸升溫至 420 ℃，待消化管中的液體呈藍(lán)綠色澄清透明后，繼續(xù)加熱 30min 后，自然冷卻。將消化管取下，使用全自動(dòng)凱氏定氮儀直接進(jìn)行蒸餾和滴定。硼酸吸收液、氫氧化鈉溶液、水加 入量分別為 30mL、 40mL、 50mL，在儀器顯示屏上讀取氮含量結(jié)果（單位 mgN?g1或 mgN?mL1），然后計(jì)算蛋白質(zhì)含量。平行試驗(yàn) 3 次，平均值為測定結(jié)果。 蛋白質(zhì)水解度 —— OPA 分光光度法 [6,7] 本研究采用 OPA分光光度法測定游離氨基氮，采用凱氏定氮法測定總氮的方法測定水解蛋白的水解度。 實(shí)驗(yàn)原理 堿性條件下， OPA 在β 巰基乙醇（β MCE）存在的條件下能夠與游離氨基迅速反應(yīng)生成 1硫代 2烷基異吲哚。此加成產(chǎn)物在 340nm 處有較強(qiáng)的吸收，并對所有的α NH2吸光系數(shù)相同， 另外α NH2和ε NH2的吸光系數(shù)也相同。運(yùn)用十二烷基磺酸鈉（ SDS）將蛋白變性后，其吸光系數(shù)將不受影響，從而可以利用分光光光度法測定蛋白質(zhì)在水解前后的游離氨基的含量，進(jìn)而能夠計(jì)算出水解過程中釋放出的游離氨基的量。 試劑的配制 （ 1） OPA 溶液：準(zhǔn)確稱取 十二烷基磺酸鈉（ SDS），加入 30mL L1的硼酸緩沖液（ pH ），水浴加熱使其完全溶解，冷卻至室溫后再加入 1mL 濃度為 80 mg mL1的 OPA 乙醇溶液和 200 μ L β 巰基乙醇，最后用 pH 的硼酸緩沖液 定容至 100mL。此溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。 （ 2） 600μ g mL1的亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：精確稱取亮氨酸 g，加入 5mL 濃度為 1moL L1的鹽酸溶液使其完全溶解，用蒸餾水定容至 100mL，其濃度為 3000 μg mL1，再取此液 10mL，用蒸餾水定容至 50mL，即配成 600μ g mL1的亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。此溶液配成后應(yīng)及時(shí)使用或放入 4℃冰箱內(nèi)保存。 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取不同體積的標(biāo)準(zhǔn)亮氨酸溶液，配成不同濃度的溶液（ 0、 1 1 2 36μ g mL1），再各取稀釋液 3mL，與同體積的 OPA試劑混合并開始計(jì)時(shí)，準(zhǔn)確計(jì)時(shí) 5 min，立即在 340nm 處測定溶液吸光值。每個(gè)濃度做 3 個(gè)平行，以吸光值的平均值為橫坐標(biāo)，亮氨酸濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 樣品中游離氨基含量和蛋白質(zhì)水解度（ DH）的測定 將待測樣品按一定倍數(shù)稀釋后，取稀釋液 3mL，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制作步驟，測定其吸光值。然后利用標(biāo)準(zhǔn)曲線所得方程，計(jì)算出樣品中游離氨基的濃度（μmoL mL1）。水解度計(jì)算公式如下，其中計(jì)算大豆分離蛋白水解度時(shí) A=；計(jì)黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)本科畢業(yè)論文 7 算酪蛋白水解度時(shí) A=： 100)/()]/()/( )/([(% ) ????? gm m olhgm m olmLmgA mLm olDH T水解物氮含量水解物游離氨基含量 ? 福林法測定蛋白質(zhì)含量 —— 氮溶解指數(shù) [9] （ 1）試劑的配置： 試劑甲： ① 4 %碳酸鈉溶液：稱取無水碳酸鈉（ Na2CO3） 20 g，定容至 500 mL； ② mol L1氫氧化鈉溶液； ③ 1 %CuSO4 5H2O：準(zhǔn)確稱取 g CuSO4 5H2O，定容至 50 mL； ④ 2 %酒石酸鉀鈉：準(zhǔn)確稱取 g酒石酸鉀鈉，定容至 50 mL。 使用前，分別將①與②、③與④等體積混合，再將兩混合液按 50︰ 1比例混合，即為試劑甲。該試劑只能用一天，過期失效 。 試劑乙：福林試劑的配置。 于 2021 mL 磨口回流裝置內(nèi)，加入鎢酸鈉（ Na2WO4 2H2O） 100 g，鉬酸鈉（ Na2MoO4 2H2O） 25 g，蒸餾水 700 mL， 85 %磷酸 50 mL，濃鹽酸 100 mL，文火回流 10 h。 取去冷凝器，加入硫酸鋰（ Li2SO4） 50 g，蒸餾水 50 mL，混勻，加入幾滴液體溴，再煮沸 15 min，以驅(qū)逐殘溴及除去顏色，溶液應(yīng)呈黃色而非綠色。若溶液仍有綠色，需要再加幾滴溴液，再煮沸除去之。冷卻后，定容至 1000mL，用漏斗過濾，置于棕色瓶中保存。此溶液使用時(shí)加 1倍蒸餾水稀釋，即成已稀釋的福林試劑。 （ 2）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液的配置： 準(zhǔn)確稱取一定量的牛血清白蛋白，配置成 mg18